治疗性HPV16Z-Hsp65-E6E7无佐剂重组蛋白疫苗的实验研究.docVIP

治疗性HPV16Z-Hsp65-E6/E7无佐剂重组蛋白疫苗的实验研究摘要 目的：研究治疗性HPV16 Z-Hsp65-E6/E7重组蛋白疫苗的抗肿瘤相关生物活性。方法：通过淋巴细胞增殖实验和细胞毒性杀伤实验研究该疫苗激发的细胞免疫反应及反应强度；研究该疫苗对小鼠TC-1肿瘤细胞移植瘤的体内治疗作用和对小鼠生存期的影响。结果：经检测证实该重组蛋白疫苗免疫小鼠后小鼠脾淋巴细胞增殖明显，并可特异性地在体外杀伤TC-1细胞，能诱导特异性的细胞免疫反应；动物体内抑瘤试验研究显示该疫苗对HPV16病毒转化的TC-1细胞小鼠移植瘤有显著的治疗作用。结论：体外实验证实该疫苗有较强的免疫原性，能激发特异性细胞免疫反应；体内显著抑制HPV16转化的TC-1肿瘤细胞生长。治疗性HPV16 Z-Hsp65-E6/E7重组蛋白疫苗的初步研究证实该疫苗的进一步研究将对HPV16病毒感染相关疾病的治疗具有实际应用价值。关键词 人乳头瘤病毒16型；治疗性疫苗；宫颈癌 The experiment study of Therapeutic Adjuvant-free protein VaccineHPV16Z-Hsp65-E6/E7abstract Objective: To study the biological effects of the HPV16Z-Hsp65-E6/E7 fusion protein vaccine on the tumor associated with HPV16 infection. Methods: We tested the cellular immune responsive intensity to the vaccine by the lymphocyte proliferation and CTL response and studied the therapeutic effect of the vaccine on mouse TC-1 cell transplanted cancer in vivo, and the influence on mouse lifetime . Results: The spleen lymphocytes from the C57BL/6 mouse immunized by the Hsp65-E6/E7 vaccine could be proliferated obviously in the presence of the protein and TC-1 tumor cell could be lysed specifically by immune activated lymphocytes In vitro. The animal therapeutic experiment in vivo showed that the vaccine could suppress the growth of TC-1 cell transplanted tumor remarkably. Conclusions: The recombined vaccine could induce specific cellular immune response in vitro and suppress HPV16 positive TC-1 tumor cell growth obviously in vivo. The preliminary study of the adjuvant-free vaccine confirmed that the further research and development of this vaccine may have the practical application value to treating the HPV16 correlative disease. key words: Human Papillomavirus 16 Therapeutic vaccine Cervical cancer HPV与多种人类上皮来源的恶性肿瘤和不典型增生的发生和发展关系密切，高危HPV16型的感染是女性宫颈癌形成的主要原因1。在我国妇女宫颈癌组织中HPV感染检出率大于99%，其中HPV16占60%以上2。世界范围内每年有40多万新发宫颈癌病例，约20万人死于该病，位居女性肿瘤死亡人数的第二位3。目前宫颈癌的治疗主要是手术和放疗，其治疗5年生存率仅50%左右，另外对宫颈的早期病变和HPV感染相关的疾病的治疗尚缺乏理想的方法。因此研制新的药物用于治疗HPV感染尤其是HPV16型引起的相关疾病具有重要意义。本试验室前期工作中在我国成功克隆了与山西省襄垣宫颈癌高发关系密切的HPV16Z株，并经突变修饰去除该病毒E6/E7致癌基因中的致癌位点，构建并表达了HPV16Z- -Hsp65-E6/E7融合蛋白治疗性基因工程疫苗4。本研究进一步观察该疫苗在体外所诱发的细胞特异性免疫反应及在鼠体内的抗TC-1移植瘤生长的生物活性。 1 材料与方法1.1 主要试剂 RPMI 1640培养基（GIBCO），小牛血清（GIBCO），LDH检测试剂盒（PROMEGA），小鼠IL-2（四环），96孔培养板（NUNC）。1.2细胞株 TC-1细胞系来源于鼠C57BL/6的肺上皮细胞，是经共转染HPV16 E6/E7和活化的c-H-ras基因后转化而得到的HPV16 E6/E7阳性细胞株5。本实验所用TC-1细胞系由病毒所惠赠。L929细胞系来源于C57BL/6鼠肺上皮细胞，为NK杀伤敏感细胞，本室保存。上述的二株细胞系用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养液，在37，5% CO2条件下培养。1.3 实验动物 C57BL/6雌鼠，6-8周龄，体重16-20g，购自医学科学院动物研究所。1.4 蛋白疫苗的制备 Hsp65-E6/E7融合蛋白由本室制备，将Hsp65-E6/E7融合蛋白保存于PBS/20%甘油中，-70冻存。1.5 小鼠的免疫及淋巴细胞的分离培养 C57BL/6雌鼠6只分2组，每组3只，分别在颈侧皮下注射200g/0.2ml Hsp65-E6/E7融合蛋白（疫苗组）和0.2ml缓冲液（对照组）。14天后再次免疫，方法、剂量和部位同第一次免疫，第二次免疫10天后脱颈处死小鼠，70%酒精中浸泡3分钟。在无菌操作台上剪开腹部，取出脾脏，用玻璃注射器芯在200目不锈钢网上轻轻研磨分离单个脾细胞。PBS冲洗不锈钢网，制成单细胞悬液备用。取预先放置到室温的淋巴细胞分离液3ml，加入15ml玻璃离心管中，将610ml单细胞悬液轻轻加到分离液上，在水平离心机中2000rpm，离心20min，吸取中间的白色界面层的淋巴细胞，PBS洗涤2次，计数，重悬于含10%的小牛血清RPMI 1640培养液中备用。1.6 淋巴细胞增殖试验 用MTT法同时检测疫苗组和对照组的小鼠脾细胞的增殖。实验分为4组，分别加入培养液（空白对照）、GST（无关蛋白对照组，终浓度为100g/ml）、Hsp65-E6/E7融合蛋白（实验组，终浓度为100g/ml）和Con A（阳性对照组，终浓度为10g/ml）。每组设3个复孔，每孔加入40万脾淋巴细胞，总体积为150l。在37，5% CO2条件下培养3天后，加入1mg/ml MTT溶液50l。37孵育4-6小时后，用酶标仪测定波长为570nm时的吸光值（OD）。计算公式：刺激指数（SI）=实验组OD值/对照组OD值。1.7 特异性杀伤实验 用LDH法测定小鼠脾淋巴细胞对靶细胞TC-1和L929细胞的杀伤作用。在圆底96孔培养板中每孔加入1104靶细胞，然后分别加入不同数量的效应细胞，使效靶比为25:1和12.5:1。同时设效应细胞自发释放孔，靶细胞自发释放孔和靶细胞最大释放孔对照。37孵育4小时，然后按LDH测定说明书操作。离心收上清，取50ul上清转入另一个平底96孔板，加入50l LDH底物混合液，室温，避光30分钟。每孔加入50l终止液，于波长490nm处测OD值。 计算公式：杀伤率（%）= 实验孔释放效应细胞自发释放靶细胞自发释放靶细胞最大释放靶细胞自发释放1.8 TC-1小鼠肿瘤移植模型的建立 收集体外培养的TC-1细胞洗2次，调整细胞密度至6.5105 /ml。在小鼠的胸前侧壁，每只皮下注射200l TC-1细胞。从注射后第三天开始观察肿瘤的生长情况，每2天观察一次。1.9 Hsp65-E6/E7重组疫苗小鼠免疫治疗性实验 28只荷瘤小鼠随机分为4组，每组7只。肿瘤接种后10天，进行第一次免疫治疗。免疫治疗的3组小鼠分别皮下注射接种50g、100g和200g Hsp65-E6/E7融合蛋白，对照组小鼠只注射融合蛋白稀释液。每四天观察并记录肿瘤的生长情况。第一次免疫治疗后的第14天，进行第二次免疫治疗，方法和剂量同第一次免疫治疗。继续观察肿瘤生长情况，直到试验结束。肿瘤体积计算方法： 肿瘤体积 长径短径的平方/21.10 统计学处理 数据用XSD表示。使用spss软件包进行统计学处理。两样本均值比较采用t检验，生存期比较采用寿命表法，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 Hsp65-E6/E7重组蛋白疫苗诱导小鼠脾淋巴细胞增殖 Hsp65-E6/E7重组蛋白疫苗对免疫后小鼠脾淋巴细胞增殖有较强的刺激作用，为3.4；而对对照小鼠脾淋巴细胞的增殖作用刺激较弱，刺激指数为1.1，如图1所示，二者差异有显著性意义（P0.01）。无关蛋白GST对免疫和对照二组小鼠脾淋巴细胞刺激增殖作用均较弱，二组的差异无显著性意义。ConA对免疫和对照小鼠脾细胞增殖都有强烈刺激作用，二组的差异无显著性意义。图1 Hsp65-E6/E7蛋白疫苗诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖2.2 小鼠脾淋巴细胞的特异性杀伤作用 特异性细胞免疫在清除病毒和杀伤肿瘤细胞方面起重要作用，用小鼠脾细胞直接进行杀伤肿瘤细胞试验可以反映免疫后体内的抗肿瘤能力。Hsp65-E6/E7重组疫苗免疫小鼠的脾细胞对HPV16阳性TC-1细胞的杀伤明显高于对照组，在效靶比为25：1的情况下，杀伤率分别为13.28%和4.26%，结果如图2所示，差异有显著性（P0.01）意义。另外我们还检测了小鼠脾细胞对HPV16阴性L929细胞的杀伤作用，发现免疫组和对照组杀伤率均很低，效靶比为25：1时分别为3.79%和2.5%，差异无显著性意义。图2 小鼠脾淋巴细胞的特异性杀伤作用2.3 Hsp65-E6/E7蛋白疫苗在小鼠体内诱导的特异性抗肿瘤作用 在C57BL/6小鼠胸前侧壁接种1.3105 TC-1细胞。接种TC-1细胞4天时，即可观察到肿瘤在小鼠皮下生长。10天时，肿瘤形成率达100%，肿瘤大小均匀，体积约8mm3 左右。分别在第10和24天进行两次免疫接种。对照组小鼠肿瘤生长迅速。40天后，对照组小鼠由于肿瘤负荷过大开始死亡；而治疗组小鼠的肿瘤生长受到抑制（图3）。在接种肿瘤细胞的第32天，对照组小鼠的平均肿瘤为7.5cm3，而治疗组的50g、100g和200g 3个剂量组的肿瘤体积分别为4.1、1.6、0.2 cm3，疫苗对肿瘤抑瘤作用呈现显著的剂量-效应关系（与对照组相比，3组的P0.05）（图4），特别是高剂量（200 g/只）治疗组，7只小鼠中的2只在第二次免疫后的36天肿瘤完全消退，且持续20天以上（图5）。治疗组（3个剂量）小鼠的生存期明显延长（P0.05）。到第64天，所有的对照小鼠（7只）全部死亡，而治疗组的50g、100g和200g组分别有30、70和100%的小鼠存活。到第120天，200g组仍有71%的动物存活（图3）。图3 疫苗对荷瘤小鼠生存期的延长作用图4 疫苗对荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制作用图5 疫苗对小鼠TC-1移植肿瘤的治疗作用3 讨论 在抗病毒和抗肿瘤免疫过程中细胞免疫起主要作用。Hsp-E6/E7重组疫苗能否在小鼠体内诱导出特异的细胞免疫反应，是鉴定疫苗免疫活性重要的技术手段。实验结果显示，Hsp65-E6/E7重组疫苗免疫的小鼠的脾淋巴细胞在体外被该疫苗再次刺激时，细胞增殖反应显著高于未免疫小鼠，表明疫苗已在小鼠体内诱导出了特异性杀伤淋巴细胞。我们的结果还显示，经该疫苗体内致敏的淋巴细胞对表达HPV16E6/E7蛋白的TC1细胞有显著特异性杀伤作用，使该疫苗具备了可能作为特异性治疗HPV感染所致相关疾病治疗的治疗性疫苗的价值。 小鼠体内接种1.3105 TC-1细胞后，大约7天左右即可观察到肿瘤形成。目前研制中的HPV疫苗，其动物实验多采用接种后7天以内开始治疗的方案，甚至在接种后4小时就开始治疗，据文献报道都有一定的疗效6,7。在我们的此次动物实验中，接种后第10天开始第一次免疫，第24天进行第二次接种。虽然开始免疫治疗的时间晚于多数的文献报道，但我们仍然观察到该疫苗有很好的体内抑瘤作用。第一次免疫后一周，治疗组肿瘤生长被遏制，有些小鼠肿瘤开始缩小，再次免疫后，治疗组肿瘤继续缩小，200g融合蛋白组的7只小鼠中有2只肿瘤完全消退，治愈率为30，其余5只小鼠的肿瘤虽未完全消退，但也没有继续生长；50g和100g组的肿瘤虽然继续生长，但速度明显比对照组缓慢。同时，对照组小鼠肿瘤生长非常迅速，最后肿瘤体积可达7.5cm3。继续观察发现对照组小鼠在第42天开始死亡，至64天全部死亡。随着时间推移（40天后），50g组和100g组小鼠的肿瘤也随之增大，开始出现死亡。200g组小鼠的肿瘤也开始增大，到120天观察结束，7只小鼠中仅死亡2只。研究结果提示，免疫治疗肿瘤过程中疫苗的使用剂量至关重要。如果开始治疗时间晚，肿瘤体积较大，免疫接种次数少，免疫系统是难以完全清除肿瘤细胞。在4个月的观察时间内，200g组的治疗效果明显，最后还有5只实验鼠存活，而对照组小鼠在70天左右全部死亡，提示该治疗性疫苗有明显的抗肿瘤作用。 目前文献报道的关于抗肿瘤的蛋白疫苗的动物实验结果很多，也观察到了一定的疗效。但由于可溶性蛋白疫苗一般免疫原性差，实验中往往添加了佐剂再进行免疫。但是，由于这些佐剂未被批准用于人体，因此，限制了这些疫苗的应用。且目前被FDA批准的唯一佐剂是Al(OH)3，该佐剂能促进体液免疫，但对治疗起重要作用的细胞免疫却无促进作用，所以无佐剂疫苗的研究已成为当今疫苗的研究热点。目前无佐剂HPV疫苗为数不多，如L1-E7、L1-E6、L2-E7 (TA-GW)、L2-E7E6 (TA-CIN)、Hsp65E7等，部分已用于临床试验，已被证实对HPV相关疾病具有一定的治疗作用。Hsp是一类结构上高度保守的蛋白，在肿瘤抗原的加工提呈中起主要作用。大量的研究表明，它在抗原提呈细胞内与肿瘤抗原降解的小肽结合，保护并运送小肽.8.9.10,11,12。由于体内最强的抗原提呈细胞树突状细胞表面存在Hsp的受体CD91，所以，它可以被树突状细胞高效摄入。因此，我们用基因工程的方法，使用我国主要HPV16流行株，设计表达Hsp和HPV16 E6/E7基因工程融合蛋白，用作针对我国HPV16阳性的宫颈癌、宫颈癌前病变和其它HPV相关疾病的疫苗，利用Hsp把HPV蛋白携带至树突状细胞，以期更好地激活免疫系统。我们制备的融合蛋白，与Stressgen研制的Hsp65E7在结构上具有一定的相似性，观察到的体内外抗肿瘤作用也类似。另外，van der berg等报道他们研制的L2-E6E7疫苗，在小鼠体内能达到70