分子生物学与慢性粒细胞白血病概要课件

分子生物学在慢粒（AML）的发病机理、基因诊断及治疗中的应用,一、概述,慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia， CML)简称慢粒。,概念：是一种发生在早期多能造血干细胞上的恶性骨髓增殖性疾病（获得性造血干细胞恶性克隆性疾病)。,Chronic myelogenous leukemia, chronic phase.,病因：CML的病因比较复杂，较为公认的致病因素是电离辐射，如X射线、射线等。暴露于辐射的人群有较高的CML发病率。日本广岛及长崎原子弹辐射后，慢粒的发病率较未照射人群高17倍。 主要特点：本病病程发展缓慢，外周血粒细胞显著增多且不成熟，脾脏明显肿大。自然病程可经历慢性期、加速期和急变期，多因急性变而死亡。本病各年龄组均可发病，以中年最多见。,二、CML分子生物学发病机理,Ph染色体与融合基因 90%以上的慢粒患者中可发现有Ph染色体，即t(9；22)(q34；q11)，9号染色体q34上的原癌基因c-ABL的片段易位至22号染色体q11上的断裂点簇集区（breakpoint cluster region，BCR），产生BCR-ABL融合基因。这也是人类在白血病染色体易位中发现的第一个融合基因。,Cytogenetic Abnormality of CML: The Ph Chromosome,9,22,Bcr/abl融合基因的结构,Bcr/abl融合蛋白与白血病,1.p210BCR-ABL, 见于绝大部分CML及50%以上成人Ph染色体阳性的ALL。 2.p190BCR-ABL, 常见于50%Ph染色体阳性的成人ALL和80%Ph染色体阳性的儿童ALL。 3.p230BCR-ABL, which is associated with rare cases of Ph-positive CML.,Bcr-abl融合基因致病的分子机制,Bcr/abl融合基因的编码产物p210、p230等融合蛋白具有很强的酪氨酸蛋白激酶活性，可激活结构性酪氨酸激酶（tyrosine kinase, TK）。而酪氨酸激酶是一种催化ATP-磷酸酶转移到蛋白质酪氨酸残基上的激酶，能催化多种底物蛋白酪氨酸残基磷酸化，进而激活细胞中多种信号转到途径，促进细胞增殖，减少细胞凋亡，最终导致慢性粒细胞白血病的发生。,三、BCR-ABL融合基因的分子生物学检测技术,1.RT-PCR ：是以 mRNA 为模板反转录出cDNA，再以 cDNA 为模板进行 PCR，是在 RNA 水平上检测 BCR-ABL 融合基因。该方法灵敏度高，可用于 MRD 的检测，但反转录-PCR 是一种定性实验，不能对白血病患者的 BCR-ABL 融合基因给出定量分析，也可能会因 RNA 降解而出现假阴性。,2.实时定量荧光-PCR：是以荧光共振能量转移原理为基础，在 PCR 扩增的同时，加入引物的同时加入特异性的荧光探针; 是通过实验检测过程中的荧光强度变化对 PCR 扩增产物进行的一种定量检测方法。实时定量荧光PCR 由于其具灵敏度高( 10 5 10 6) 、可准确定量观察、迅速、重复性好等优点，在MRD 检测中具有非常重要的优势。,3.CBA 法：是指用已知大小及性质的磁珠与一组可溶的蛋白分析物结合，以检测人类血液样本的 BCR-ABL 融合蛋白。其检测试剂为一种结合藻红蛋白( phycoerythrin，PE) 的单克隆抗体，可对 BCR-ABL 蛋白的 ABL 特异性结合，当免疫磁珠与 BCR-ABL 融合蛋白共混时，则可形成三明治状的复合物，蛋白的 BCR 端为结合了抗体的微球，ABL 端为结合了藻红蛋白的抗体。基于抗体的大小及性质，可使用流式细胞仪对该种复合物进行研究，从而检测出 BCR-ABL 融合蛋白。,BCR-ABL 融合基因可翻译产生融合蛋白可以被抗 BCR 的捕获磁珠及连接 PE 的抗 ABL 抗体结合。在流式细胞仪上对捕获磁珠的检测，可检测出 PE 的荧光信号。,4.FISH 法：是利用标记的 DNA 或 RNA 探针直接在染色体、细胞或组织水平定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术，可同时分析分裂期和间期的多个细胞，并进行定量。主要应用于染色体易位形成的融合基因检测、基因缺失的检测及MRD检测等。具有快速、安全、经济、灵敏度高、特异性强等优点。对白血病临床疗效的判定及预测预后也具有重要意义。,5.Southern印迹(Southern Blot) 法 可对bcr-abl融合基因DNA重排进行分子生物学检测。将待测基因组DNA片段经电泳分离后转移到固相杂交膜上，用取自M-bcr3和5端的bcr探针与之杂交，经放射自显影洗片后即可显示所要检测的条带，对于CML患者，除可见到一条与胚系bcr基因组DNA相对应的条带外，其他的条带说明存在重排的bcr等位基因。,Southen 印记法实验流程图,四、分子靶向治疗（molecular targeting treatment）,信号传导抑制剂 ( Signal Transduction Inhibitor , STI),分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂,甲磺酸伊马替尼（imatinib mesylate），商品名为格列卫，为治疗CML的常用分子靶向药物。属小分子化合物，是一种特异性很强的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）。对体内众多酪氨酸激酶，它仅能抑制BCR-ABL融合基因产物P210和P190、PDGFR（血小板衍化生长因子）与c-Kit受体的酪氨酸激酶。,格列卫药理作用的分子机制,格列卫通过特异性地与BCR/ABL激酶结构域的ATP位点结合，抑制其酪氨酸激酶活性,使酪氨酸残基不能磷酸化，从而抑制其细胞信号传导途径,促使细胞凋亡和抑制Ph阳性白血病细胞的增殖。 格列卫是CML治疗史上的里程牌,并且对CML具有很好的疗效，可使患者达到遗传学或分子生物学缓解。,Mechanism of action of imatinib.,By occupying the ATP binding pocket of the ABL kinase domain, imatinib prevents substrate phosphorylation and downstream ac