用sephadexG50分离核黄素与丙.ppt

SephadexG50分离 核黄与丙球,实验原理,葡聚糖凝胶：外国商品名为Sephadex,它是由葡聚糖Dextran交联而成。葡聚糖是血浆的代用品，由蔗糖发酵而来。发酵得到的葡聚糖相对分子质量差别很大，用乙醇进行部分沉淀后，选择相对分子量为3000050000的部分，经交联后就得到不溶于水的葡聚糖凝胶，在制备凝胶时添加不同比例的交联剂可得到交联度（交联剂在原料总质量中所占的百分数）不同的凝胶。,交联度越大，网状结构越紧密，吸水量越小，吸水后体积膨胀越少。凝胶的型号就是根据吸水量而来，如G25的吸水量（1g干胶所吸水为25mL）型号数字相当于吸水量乘以10 葡聚糖凝胶的化学性质比较稳定，不溶于水，弱酸、弱碱和盐溶液。本身具有很弱的酸性。在120加热30分钟灭菌而不被破坏。但高于120即便黄，若长时间不用，需加防腐剂,葡聚糖凝胶G50的性质,干粒直径：粗粒100300中粒50150细粒2080极细1040 吸水量：5.00.3mL/g干凝胶 膨胀体积：911mL/g 分离肽或球状蛋白：150030000 浸泡时间：20需3h;100需1h,名词解释,核黄素：维生素B2，又称核黄素，维他命B2。分子式C17H20N4O6。作为维生素B族的成员之一，核黄素水溶性较低，但在碱性溶液中容易溶解，在强酸溶液中稳定，光照及紫外照射引起不可逆的分解。可溶于氯化钠溶液，维生素B2是机体中许多酶系统的重要辅基的组成成分，参与物质和能量代谢。核黄素在机体中有递氢的作用，并是机体中一些重要的氧化还原酶的辅酶。,丙种球蛋白：按其来源不同可分为两种，一种是从健康人静脉血中提取制成的人血丙种球蛋白，另一种是从健康人胎盘血中提取制成的人胎盘血丙种球蛋白。二者作用相同，后者价格低于前者，且用量多于前者，但目前已停产。有些人盲目地、错误地认为丙种球蛋白是营养药、是补针，于是不管病情轻重、有病无病地滥用，结果会导致不良反应,实验试剂与器材,葡聚糖G50悬液 样品液 层析柱（玻璃管）、橡皮筋、乳胶管 微量进样器、长针头、 铁架台,实验步骤,装柱：取直径0.81.2cm，长度为25cm的层析柱，在上口绕橡皮筋，出口处装有乳胶管，柱内加蒸馏水23mL,排出乳胶管内的气泡，抬高乳胶管防止柱内蒸馏水排空，自顶部缓缓加入经膨胀的葡聚糖G50悬液，待顶部凝胶沉淀23cm时将乳胶管放低，仍继续加入上述悬液至凝胶层积至18cm高度即可。操作过程中应防止气泡与分层现象的发生，让凝胶自然下沉。使表面平整。,平整胶面：待凝胶柱层稳定后，以洗脱液（蒸馏水）洗柱5分钟，调节流速至4滴/min 加样：待蒸馏水流至柱面平时（注意不可使柱面干掉）马上沿层析柱内壁小心加4滴样品于柱床面，注意尽量不使床面搅动，马上加入12倍样品体积的蒸馏水，反复两次，可加大量蒸馏水洗脱，这样可使样品稀释最小,洗脱：样品一旦加入后马上用量筒或刻度离心管收集流出液，床柱上不断加蒸馏水，待红色（血红蛋白）流出一半时记录体积，此时血红蛋白Ve也为V0继续收集流出液，待黄色（核黄素）流出一半时记录体积，此时核黄素Ve 用蒸馏水反复加在柱床上面，洗柱10分钟，然后将主柱内凝胶回收在凝胶瓶内,实验中注意事项,在收集过程中，要保持流出液的流速稳定，洗脱速度