自然科学荧光pcr同步检测细小脲原体和沙眼衣原体及解脲支原体基因分群分型研究武汉百泰基因课件

王业富 教授/博导 完成单位：武汉大学生命科学学院 武汉大学病毒学国家重点实验室 武汉百泰基因工程有限公司,国家重大专项资助项目：2008ZX10004-006 FQ-PCR同步检测细小脲原体和沙眼衣原体及解脲支原体基因分群分型研究,主要内容,(2)研究目的,(3)研究内容,(4)研究总结与创新点,(5)研究成果,(1)研究背景,研究背景,解脲支原体和沙眼衣原体是常见的性传播疾病病原体，在临床非淋菌性尿道炎（NGU）病人中，二者常常呈共同感染状态。,近年来，解脲支原体的致病机理和流行病学研究得到了充分的重视。最近的研究表明，解脲支原体应该分为两个独立的种，即细小脲原体（原解脲支原体生物一群）和解脲脲原体（原解脲支原体生物二群），从生殖道分离到的解脲支原体以细小脲原体为主。,PCR法：近年来PCR法在解脲支原体和沙眼衣原体的临床样品检测中被广泛使用，但是PCR法需要对PCR产物进行后处理，不仅费时而且交叉污染容易导致假阳性结果，并且会对环境造成污染、对实验人员造成潜在的危害。,传统的解脲支原体检测主要是选择培养法，常规的沙眼衣原体检测方法是免疫学方法。这些方法劳动量大，耗时，而且灵敏度低或特异性差。,M1,M2,M4,M3,以上检测方法均不能对起始模板进行准确定量！,研究背景,解脲支原体是较常见的泌尿生殖道寄生菌，当临床检查到解脲支原体，并不能确定是携带状态还是感染状态，这给诊断与治疗带来困难，是临床中亟待解决的问题。,研究认为存在于人类泌尿生殖道中的主要是细小脲原体（即解脲支原体生物一群），且与人类的疾病存在一定的关系。但目前的血清学分型法和以常规PCR为基础的基因分群分型法都不够完善，以完全令人信服的证据来确证到底是哪种或者哪些型别的解脲支原体跟致病密切相关。,研发出针对细小脲原体和沙眼衣原体的特异性强、灵敏度高、快速、同步、准确定量的检测方法对临床诊断及治疗具有重要意义。,研发出将解脲支原体进行有效的基因分群分型方法，建立一个公认的标准化分群和分型方法，来探讨其与致病性的关系，这对解脲支原体感染的致病机理研究和防治具有重要的意义。,实时荧光定量PCR简介,实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个循环，收集一次荧光信号强度，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，从而得到一条荧光扩增曲线图，通过分析每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（Ct值），结合标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 。 荧光域值（threshold）的设定：荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。,实时荧光定量PCR简介,实时荧光定量PCR简介,Ct值的重现性：PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。 右图为：相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图，终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性。,研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,实时荧光定量PCR简介,荧光探针和荧光染料,探针类由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但非探针类则简便易行。,实时荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。,非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加，如SYBR Green I ，LUX引物。,荧光染料,荧光探针,探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，如：分子信标， TaqMan探针，双杂交探针。,TaqMan探针 ：该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5 3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,TaqMan探针,荧光探针和荧光染料,实时TaqMan荧光定量PCR技术中，TaqMan探针与目标PCR片断上的对应序列是完全互补的，如果目标PCR片断上的对应互补序列上有1个或多个碱基发生突变，那么TaqMan探针将无法和互补序列结合，TaqMan探针将不会被Taq酶酶切水解，因此将不会显示出荧光的累积。这就是TaqMan探针的单核苷酸多态性（SNP）分析功能。,荧光探针和荧光染料,TaqManMGB探针技术是在TaqMan探针基础上发展起来的一种新技术, TaqMan探针的3端结合上MGB，即DNA小沟结合物 。其能嵌入DNA双螺旋结构中的小沟形成非共价结合,有效提高探针的退火温度 。 TaqManMGB探针较TaqMan探针具有更高的敏感性和特异性，是分析单核苷酸突变的有效工具。,TaqManMGB探针,荧光探针和荧光染料,实时荧光定量PCR的应用,目前，实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：,利用实时TaqMan荧光定量PCR技术和双重PCR技术，研发出双重实时TaqMan荧光定量PCR反应体系，可以用于临床上快速、高特异性、高灵敏度、精确定量、同步检测细小脲原体和沙眼衣原体；,本项研究设计了两套实时TaqMan荧光定量PCR反应体系，利用两套特异性引物和TaqMan-MGB探针，可以分别对细小脲原体和解脲脲原体进行快速鉴别分群和定量检测，可以迅速鉴定临床样品中是生物一群或/和生物群二，以及各群的精确数量；,本项研究设计了两套双重实时TaqMan荧光PCR反应体系，利用一对通用引物和四条特异性TaqMan -MGB探针，通过两个双重荧光PCR可以快速对细小脲原体四个血清型进行检测和分型。,本研究目的,研究目的,研究内容,第一部分,双重实时TaqMan荧光定量PCR同步检测细小脲原体和沙眼衣原体,TaqMan探针和引物序列设计,目标检测基因 ：解脲支原体ure基因 沙眼衣原体trp基因 在NCBI 获得解脲支原体14个血清型的脲酶基因序列，沙眼衣原体14个血清型的trp基因序列 。 在www.ebi.ac.uk/ 在线分别对解脲支原体14个血清型的脲酶基因序列和沙眼衣原体14个血清型的trp基因序列进行序列比对 。 用TaqMan荧光PCR的专业设计软件Primer Express 2.0 software (Applied Biosystems, Foster City, CA)设计解脲支原体和沙眼衣原体的候选引物、探针序列 。,研究内容,经过一系列实验优化，最后确定的沙眼衣原体引物、探针序列为：,FAM的吸收光波长为494nm，发射光波长为525nm。,TaqMan探针和引物序列设计,研究内容,经过一系列实验优化，最后确定的细小脲原体引物、探针序列为：,HEX的吸收光波长为535nm，发射光波长为556nm。,TaqMan探针和引物序列设计,研究内容,（1）,（2）,（3）,细小脲原体序列比对分析,研究内容,细小脲原体引物探针在线分析,研究内容,r：g 或者a；y：t或者c。,研究内容,沙眼衣原体序列比对分析,研究内容,沙眼衣原体在线比对分析,研究内容,常规PCR反应体系优化,研究内容,常规PCR反应体系优化,研究内容,A B C D E F G,A：DNA size marker 500,400,350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 bp B：双重PCR产物 C：双重PCR阴性对照； D：沙眼衣原体PCR产物 E：沙眼衣原体阴性对照 F：细小脲原体PCR产物 G：细小脲原体阴性对照,细小脲原体和沙眼衣原体标准株 单个和双重PCR产物凝胶电泳图,研究内容,常规PCR产物经回收，纯化，AT连接至pUCm-T 载体中，再转化到大肠杆菌DH5。培养后用蓝白斑法筛选含重组质粒的阳性克隆，然后挑选阳性克隆进行培养和质粒提取，提取的质粒进行EcoR I 和 BamH I双酶切鉴定后再进行双向序列测定。,标准品的制备和鉴定,研究内容,A B C,A：含细小脲原体目标片断的重组质粒双酶切产物 219（108111）bp B：含沙眼衣原体目标片断的重组质粒双酶切产物 181（10873）bp C：DNA size marker 500,400,350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 bp,含细小脲原体和沙眼衣原体目标片断 的重组质粒双酶切凝胶电泳图,研究内容,荧光PCR反应体系的优化,荧光PCR反应使用的仪器为：The iCycler iQTM 多色实时PCR检测系统 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)。,研究内容,右图：The iCycler iQTM 多色实时PCR检测系统可重复性研究结果。,荧光PCR反应Ct值可重复性研究,研究内容,荧光PCR反应特异性研究,研究内容,由于细小脲原体和沙眼衣原体双重荧光PCR体系中，引物与探针之间难以避免的相互干扰作用，细小脲原体和沙眼衣原体双重荧光PCR的有效检测范围降低了12个数量级，只有101106拷贝/微升左右。 右图为：双重荧光PCR体系中细小脲原体的荧光曲线和标准曲线图，有效检测范围为 101106 拷贝/微升。 灵敏度为10拷贝/微升。,定量检测标准曲线与灵敏度分析,研究内容,右图为：双重荧光PCR体系中沙眼衣原体的荧光曲线和标准曲线图，有效检测范围为102106拷贝/微升。 灵敏度为102拷贝/微升。,定量检测标准曲线与灵敏度分析,研究内容,双重荧光PCR临床标本检测应用,研究内容,实时TaqMan荧光定量PCR定量检测与鉴别细小脲原体和解脲脲原体,第二部分,研究内容,TaqMan-MGB探针和引物序列设计,选择脲酶基因作为目标基因，经过一系列实验优化，最后确定的细小脲原体和解脲脲原体引物、TaqMan-MGB探针序列如下：,细小脲原体：,研究内容,解脲脲原体：,解脲脲原体引物和探针中大写字母表示细小脲原体和解脲脲原体之间不同的碱基。,TaqMan-MGB探针和引物序列设计,研究内容,（1）,（2）,（3）,细小脲原体及解脲脲原体基因序列 比对分析,研究内容,阳性对照标准株模板进行常规PCR，使用与实时TaqMan荧光定量PCR反应体系中相同的引物对，以便将常规PCR检测和实时TaqMan荧光定量PCR检测直接进行比较。,常规PCR及PCR产物克隆,研究内容,常规PCR及PCR产物克隆,研究内容,阳性对照标准株 PCR产物用于构建克隆。 含阳性对照标准株细小脲原体血清型6和解脲脲原体血清型2目标片断的重组质粒用限制性内切酶EcoR I和BamH I分别进行双酶切的产物凝胶电泳图 。 A：DNA size marker 622，527，404，309，242，201，190，160，147，123bp B：含细小脲原体目标片断的重组质粒双酶切产物 219（108111）bp C：含和解脲脲原体目标片断的重组质粒双酶切产物 218（108110）bp,A B C,常规PCR及PCR产物克隆,研究内容,A7琼脂法：解脲支原体(包括细小脲原体和和解脲脲原体)会形成15m100m的棕黑色海胆状菌落。 培养法不能区别鉴别细小脲原体和和解脲脲原体。,临床标本的培养法检测,研究内容,荧光PCR体系的优化,荧光PCR反应使用的仪器为：Rotor-Gene实时PCR检测系统，检测结果判读标准为：检测样品的Ct值32时，为阳性结果；检测样品的Ct值32时，为阴性结果。,研究内容,Rotor-Gene实时PCR检测系统可重复性研究结果。以含细小脲原体目标片段重组质粒的104拷贝/微升标准品作为模板，以完全相同的反应体系，同时进行5个并列的实验，得到的荧光扩增曲线图,荧光PCR反应Ct值可重复性研究,研究内容,实时TaqMan荧光定量PCR的特异性,我们使用2个阳性标准株细小脲原体血清型6和解脲脲原体血清型2，12个临床分离株，3个阴性对照标准株和阴性对照（无菌水）来验证这2个实时TaqMan荧光定量PCR实验体系的特异性。,在细小脲原体实时TaqMan荧光定量PCR反应体系中，只有细小脲原体血清型6和9个细小脲原体临床分离株可以产生扩增荧光曲线。,在解脲脲原体实时TaqMan荧光定量PCR反应体系中，只有解脲脲原体血清型2和3个解脲脲原体临床分离株可以产生扩增荧光曲线。,3个阴性对照标准株和阴性对照（无菌水）在40个循环时仍没有扩增荧光曲线出现，表明这2个实时TaqMan荧光定量PCR实验体系具有很好的特异性。,研究内容,用含细小脲原体目标片断的重组质粒108101拷贝/微升十倍系列梯度稀释做模板，构建细小脲原体实时荧光定量PCR的标准曲线。 线性相关系数为0.9895 检测极限（灵敏度）为101个拷贝/反应体系。,定量检测标准曲线与灵敏度分析,研究内容,用含解脲脲原体目标片断的重组质粒107101拷贝/微升10倍系列梯度稀释做模板，构建解脲脲原体实时荧光定量PCR的标准曲线。 线性相关系数为0.9956 检测极限（灵敏度）为10个拷贝/反应体系。,定量检测标准曲线与灵敏度分析,研究内容,荧光PCR和培养法、常规PCR检测临床 样品结果的比较,研究内容,第三部分,双重实时TaqMan荧光PCR同步检测和基因分型细小脲原体,研究内容,目标基因序列的确定：通过分析解脲支原体的多条带抗原 （mba）基因序列，我们发现mba基因作为解脲支原体的重要抗原基因，其碱基序列既具有保守性，同时在不同血清型之间具有一定的变异，使用TaqMan-MGB探针技术，这些变异足够用来区分细小脲原体各血清型。,TaqMan-MGB探针和引物序列设计,研究内容,经过一系列的实验优化，从多对候选引物探针组合中，最后确定的细小脲原体通用引物和型特异性TaqManMGB探针序列如下 ： 细小脲原体四种血清型通用引物：,细小脲原体血清型1，3，14的PCR产物长度为216bp，细小脲原体血清型6的PCR产物长度为217bp。,TaqMan-MGB探针和引物序列设计,研究内容,细小脲原体型特异性TaqManMGB探针序列如下 ：,TaqMan-MGB探针和引物序列设计,研究内容,用A7琼脂法从临床标本中分离得到解脲支原体单菌落（棕黑色海胆状菌落）放大培养。 利用上一部分中，我们建立的实时TaqMan荧光定量PCR反应体系，将解脲支原体分群为细小脲原体和解脲脲原体，只选择其中的细小脲原体。 本方法得到的临床株为细小脲原体株型。,临床株的分离培养,研究内容,常规PCR及PCR产物克隆,研究内容,阳性对照标准株和临床分离株PCR产物均用于构建克隆，以验证阳性对照标准株的型别和确定细小脲原体具体属于哪个型。 本实验中构建的双重实时荧光PCR体系不使用系列梯度稀释的重组质粒制备定量标准曲线，不对样品进行定量分析。,TaqMan-MGB探针和引物序列设计,研究内容,含阳性对照标准株细小脲原体血清型1和临床分离株Upcis-001目标片断的重组质粒，分别用限制性内切酶EcoR I和BamH I进行双酶切的产物凝胶电泳图 A：DNA size marker 622，527，404，309，242，201，190，160，147，123bp B：含细小脲原体血清型1目标片断的重组质粒双酶切产物（108+216=324bp） C：含临床分离株Upcis-001（血清型3）目标片断的重组质粒双酶切产物（108+216=324bp）,A B C,TaqMan-MGB探针和引物序列设计,研究内容,双重实时荧光PCR方法建立,荧光PCR反应使用的仪器为：iCycler iQTM 多色实时PCR检测仪，检测结果判读标准为：检测样品的Ct值32时，为阳性结果；检测样品的Ct值32时，为阴性结果。,研究内容,我们使用细小脲原体标准株血清型1、3、6、14，4个阴性对照标准株，24个细小脲原体临床分离株和无菌水阴性对照作为模板进行实验，来验证“细小脲原体1/14双重实时荧光PCR反应体系”和“细小脲原体3/6双重实时荧光PCR反应体系”的特异性。,双重实时荧光PCR特异性研究,研究内容,当血清型1和14模板同时加入“细小脲原体1/14双重实时荧光PCR反应体系”时，iCycler iQTM 多色实时PCR检测仪可以同时产生2条扩增荧光曲线（FAM和HEX）。,当血清型1或14模板加入“细小脲原体1/14双重实时荧光PCR反应体系”时，iCycler iQTM 多色实时PCR检测仪可以产生1条相应的扩增荧光曲线（FAM或HEX）,当血清型3或6，或无菌水，或4个阴性对照标准株作为模板加入“细小脲原体1/14双重实时荧光PCR反应体系”时，iCycler iQTM 多色实时PCR检测仪经过40个循环后都不能产生扩增荧光曲线。,由此表明，“细小脲原体1/14双重实时荧光PCR反应体系”具有很好的特异性。 按照以上方案进行的特异性评估实验证明“细小脲原体3/6双重实时荧光PCR反应体系”的特异性也很高。,研究内容,临床标本检测结果分析,研究内容,通过整合实时TaqMan荧光定量PCR技术进行基因定量的功能、TaqMan-MGB探针有效区分单核苷酸变异进行基因分型的功能和双重PCR技术，经过一系列的创造性研究工作和反复优化实验,研究总结与创新点,Title,我们研发的“双重实时TaqMan荧光定量PCR反应体系”可以用于临床上快速、同步、定量检测细小脲原体和沙眼衣原体；,我们研发的“两套单个实时TaqMan荧光定量PCR反应体系”可以用于迅速鉴定临床样品是生物一群或/和生物二群，以及确定各群的精确数量；,我们研发的“两套双重实时TaqMan荧光PCR反应体系”可以用于快速对细小脲原体进行定性检测和基因分型。,Title,Title,以上分子生物学检测方法和基因分群分型方法对细小脲原体和沙眼衣原体的临床诊断及治疗具有重要意义，对解脲支原体感染的致病机理和流行病学研究至关重要。,主要研究成果,达到国际先进水平,获得的国家专利,快速检测沙眼衣原体的荧光定量PCR试剂盒， 发明人：曹轩；王业富， 专利号：ZL 2006 1 0018766.8 快速检测细小脲原体的荧光定量PCR试剂盒， 发明人：曹轩；王业富， 专利号：ZL 2006 1 0018767.2 同步检测沙眼衣原体和细小脲原体的荧光定量PCR试剂盒， 发明人：王业富；曹轩， 专利号：ZL 2006 1 0018768.7,主要研究成果,主要研究成果,项目已发表的SCI论文,Cao X, Jiang Z, Wang Y, Gong R, Zhang C., “Two multiplex real-time TaqMan polymerase chain reaction systems for simultaneous detecting and serotyping of Ureaplasma parvum.” Diagn Microbiol Infect Dis. 2007（59）109111.（IF=2.553） Cao X, Wang Y, Hu X, Qing H, Wang H., “Real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for quantitative detection and differentiation of Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum.”, Diagn Microbiol Infect Dis. 2007 57(4):373-8. （IF=2.553） Cao X, Wang YF, Zhang CF, Gao WJ., “Visual DNA microarrays for simultaneous detection of Ureaplasma urealyticum and Chlamydia trachomatis coupled with multiplex asymmetrical PCR.”, Biosens Bioelectron. 2006;22(3):393-8. (IF=5.061) Jingfeng Tang, Li Zhou, Yefu Wang. Novel multiplex real-time PCR system using the SNP technology for the simultaneous diagnosis of Chlamydia trachomatis, Ureaplasma parvum and Ureaplasma urealyticum and genetic typing of serovars of C. trachomatis and U. parvum in NGU. Molecular and Cellular Probes 25 (2011) 55-59.（IF= 2.553 ） Jingfeng Tang, Zhenghui Yefu Wang. Rapid and Simultaneous Detection of Ureaplasma Parvum and Chlamydia Trachomatis Antibodies based on Visual Protein Microarray using Gold Nanoparticles and Silver Enhancement, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 67 (2010) 122128. （IF= 2.553 ）,主要研究成果,项目已发表的SCI论文,主要研究成果,双重FQ-PCR鉴别检测细小脲原体和解脲脲原体及其分型研究,目视化基因芯片同步鉴别检测细小脲原体和沙眼衣原体,项目已发表的SCI论文,主要研究成果,目视化蛋白芯片同步鉴别检测细小脲原体和沙眼衣原体,基于SNP技术鉴别检测细小脲原体、解脲脲原体、沙眼衣原体及对沙眼衣原体的分型研究,项目已发表的SCI论文,主要研究成果,部分研究成果已形成产品,主要研究成果,主要研究成果,已获产品注册证书,I、病原体检测系列 淋球菌（NG）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 人风疹病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 人乳头瘤病毒（16,18型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 单纯疱疹病毒I型核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 单纯疱疹病毒II型核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 单纯疱疹病毒I型和II型核酸双检试剂盒（PCR-荧光探针法） 肠道病毒71型核