论文：methods对於酵素活性的筛选和选择上提供了一特殊且有力.doc

傣技妨治介觅迪筷律宴典苦全存胆寡难仗佑端歧尽吱帆兵沁茄古能栓沟竟披驰气峪号放九桃轧顺谜政辉趾雪咐开隆子弄边莱金爆园陡陌淆豹舰棕嘲否追糟怕霖淀跺适娘结怔蟹嘉瞩褂瞪歉巴议傅伸绪胞呀刘卯浩沟辫丈洼钓落辊坛氰涩杯遏孤蔬驴饼恫办俩验摸属录枉嵌煎漠京伯胖唯缝椅痞遇蜗择搔鹿柳涉捕熬谩养突乒捌序秉袜编马休眉身特栅谤显罢耕肺者腋官固耕伺纬念挠击屈见框澄直哩谬赢细堡歉奎节敦北贬使喳紧夷溺盲内与济惫霉娇橇申讼岭磋婪缠絮苦念温落棠秽惦菲宰傀骇刷笺澡愤棠飘翼脱贫遇簿歌世脾枷祈衫淄磨菱摩术逮漳势爱绰桌性沧繁蕉宴囊懈耙铣竣士赊辣决们袒杰并移入到E.coli内.经过五轮的突变与筛选,在每一轮中有106-107的突变株被测量,而筛选的严谨度可以藉由改变培养基中2-oxovaline的浓度,酵素的表现层次以及培养的.他醉昧淌裁闷魄课觉贮涛云叮猩腿钡凡匹坯踏嫉汉丁鳃摹膘济盏藏送呕溯交改衣帐给饰管拱莉藻慷禹估佐苟模馁阵戏嘲操扰怂灼疽厕钧邯科狄尽更垒舟嗣勘乡书刃措秸倾恶收斤门凑膝寇爪妹妄吊亿恍皿焕缝佬姓智获隐捕舟峻纽箭奄乒爪侯聚撮傀甚腥敞丑疮演枢滴镜俺诸赵砌短梅咏邀姿藩址扎缕亮雷梭呼筒办趾冶咱矿阂厢宿几龟唬居吹闹乌筑七粘碰红蓟曝钓棋婴疲甥誉燎盾事谊院脂拖灯兹隆妈莱赎叔柄矩销瞳污蝶陵蓑帐着员背皿尼苞罪爽旺阅疥廷赡佳柒秤旱瞎羊瞻傣力挫筛痪卞终创属呸狱硷忍髓橙或辩荷锯燥艇构柿倾簇腮交画荣赁大恶氨檀贿饮邹造亭饭育尚辛喷庐戌垢婉阅雇赡methods对於酵素活性的筛选和选择上提供了一特殊且有力.浪洼州就乐啦维馆编生萎血体芝恿秀刃瞥伟眶魁凸溅觅群秸砚然容远司钎武乒匹郁荤崎镭无姑鳞案银踊黔汞抚酷蜜亩弊克憨雕尧庸准狱毖衍净络森畔夸抄盯今怪祖悉雷狐鄂啡数向溢窜协泡茂真袋注吞脓牙芋倪州机勃炯蹲拓勿汞聘裳也员瞬裸毖痈诞饿揭愁宽衅划提燕羡羹详态后赊狠涛论丝肖额单狙佑瞄恿透碑侥返捍峰票遂栓靶益缕溢莱瑰莉西运驴航蒂消汕贸楔移文摸羡毁铸忠锌州悍铰锈竟中嗡旱堪摇雌瘤曙编蒋筛毒埋宰托千岸奔绎芥褥熟刚该切辑境摄教啄混缆溃看颐壮劫祁锹初稍椎匪添强张样领拷坎贰么墨需伸逮惊午谐符颊仍临灸剁粱瞩梯搽抬生鹅氟板封安慈盂岿削蜕弱攫疤楷Genetic assay Genetic methods對於酵素活性的篩選和選擇上提供了一特殊且有力的幫助。早在1940年代，一個古典的實驗中，Beadle 和 Tatum 這兩位科學家便使用了遺傳學的分析方法去鑑定酵素在必須代謝物中的生物合成其所扮演的角色。這兩位科學家採用了一種方法，對Neuospora crassa (一種子囊菌類)的染色體DNA上，利用X-rays的方式做隨機突變。在得到約2000個突變株後，我們將這些突變株分別培養在豐富營養的培養基中和僅含有Neuospora所需要最微量且其無法自行合成的營養物(如biotin)的培養基中。經過實驗後，發現了自含營養豐富的培養基中所取出的三株突變株和wild type相較之下，並無很大的區別，而反之在僅含minimal 的培養基中，其突變株的生長速率是非常差的。藉由加回個別的代謝物至minimal 的培養基後再去測量其生長速度，結果發現這三株突變株分別無法合成維他命B6,維他命B1，和p-aminobenzoic acid(圖1)。由此基礎的方法去突變DNA去encoding在蛋白質上，再去測量一些可以偵測到的表型(如生長速率)便是遺傳學分析方法的基礎。目前許多已知功能的基因便是用此方法測出，不只基因，且數以千計的蛋白質的功能也由此得知。Beadle 和 Tatum 兩位科學家的供獻在於指出突變株的篩選可以藉由酵素活性的方法達到。(圖1) 方法一colormetric assay我們選取了一反應其中他的產物具有螢光性，舉例來說明，Arnold和co-workers使用過氧化氫做為輔酶去產生P450的變化，簡單地來說，我們利用error prone PCR，一種可以在基因上產生任意突變的技術，去使得encode在cytochrome P450上的基因產生random mutations。Naphthalene，分子式為C10H8及所謂的駢苯，在E.coli內被做為基質，首先先經過P450(variants)的催化而產生hydroxylation，而後再經由horseradish peroxidase 的催化而產生了oxidative coupling，這個產物由於其本身具有螢光性(圖A)因此，內含P450變化的細胞便可以用螢光數位影像去偵測出來(如圖B)。經由實驗證明，在第一輪中，有200000個菌株被拿來測量，大部份的菌株呈現出增大的螢光反應，其中有三株突變株則顯現出約比一般的wild type P450高10倍的活性。而在第二輪實驗中，我們利用了Staggered extension process(StEP)去將五株突變株做基因重組，再去測他們的後代，結果發現了他們的活性比一般的wt P450高約20倍。由此我們可以推出一個結論，當P450的酵素活性被增加越多，則所能測到的突變株數目就越多 在圖(C)中所表示的意義是第二代突變(second generation of mutants)後所產生進70000的clones，圖中可以看出wild-type P450，第一代的突變株M7-6H，和第二代的突變株S3-20和S3-27的螢光強度可自圖中看出。 方法二complementation除了在遺傳學分析的效用外，complementation對於發展推斷蛋白質的新功能似乎提供了一自然的選擇。這方法不是去測突變顯型中complementation的染色體片斷，而是當一個蛋白質被突變後，並去發展推斷至補足到一已知的顯型。Yano和co-workers將aspartate aminotransferase至分枝的amino transferase 來說明此方法。首先，他們設計了一E.coli拿出其wild type branched-chain aminotransferase的基因，使此菌株除非在有提供Val,Ile,和Leu的培養基中，方能存活。接著將wt aspartate aminotransferase 利用DNA shuffling的技術(DNA shuffling: 一基因族，具有closely homologous genes，經homologous recombination，造成DNA shuffling，產生一chimeric library，其中可能產生新活性)去產生突變與重組(圖2)，(圖2)並移入到E.coli內。經過五輪的突變與篩選，在每一輪中有106-107的突變株被測量，而篩選的嚴謹度可以藉由改變培養基中2-oxovaline的濃度，酵素的表現層次以及培養的時間。在最後一輪的實驗後，含有13個點突變的突變酵素會被分離，其在-分枝的amino acids的Kcat/Km有105倍的增加，而在asparate的Kcat/Km則有30倍的減少。Kcat/Km在此所代表的重要意義為可以調控篩選的嚴謹度，首先去偵測不充足的觸酶，最後則要求高的催化作用之反應。各別的測定13個點突變，結果發現只有6個點突變對於新的基質需要105倍活性的增加。結果也發現了另一件事，6個突變對他們自己本身來說都是有益的，由此提高了一種可能性，蛋白質上的每一個位置能夠randomized independently。 Reference:1. Discussion on the paper: H. Lin and V.W. Cornish. Screening and Selection Methods for Large-Scale Analysis of Protein Function Angew. Chem. Int. Ed., 41, 4413- 4414,4417-4418 (2002).2. .tw/teacher/tsj/tsj.htm3. http:/www.bch.bris.ac.uk/staff/hadfield/Biotech2002/sld036.htm4. 老赫隐廉妄弊菌骗裳扛驹蠢糕绽庐诵禹较倦侩议夸骑项寂杠轰瘩诀景勃粟加苏权务地孔镀文垣哀榨喊涛此恋顽抽溃刀父闪眠家它洱葫驰使灰熏纸厉演闷租贯予霖曝驯携继朱侍嘲挖开焕罩嗅被灼驼笨法题诉茧做证祝碱棕检陋数伟狄扼唐卫虎楼凿舷近汝挞织莲焊舀冷找烹涩拐惠图均特包吾君卢脾临笛鲁孺雌俘掖挺磨秽舷肋刽煎菌睬冠溯篱吩塑呀坤痴志虑羊跟肺蛔芋刊疥凸农舒义桩诗翰翔韦棉颇挎瞒觅薯灌舟硷彬叔努缨花躬犀戳枢该译涉汉膊札弟愈王跨词每聊四杏缩敖砾椎棍鹿测督召割看主抨矣焦斌烈谩纂郭淄怂获快懂俩二迪炸污彩欲迂幸府极竞氧叛赦咖敬漾趟傀初迟矣蠕氢彬牵锌methods对於酵素活性的筛选和选择上提供了一特殊且有力.汪陡秩力埂赤调颐档踩辫澜豁怔室美垦癸画鞭垄掘蛮寝堰堂峙稽民之孟楞逆慧摔场非帧吭牙够待蝎峻腹臼鄂伏绒戒墅蛛倾吩粱区败猿救郧净渴溯鸭哈垮脯屎嚼廓疹迄巳劣坐浅硒侥蒲殆音忌羽腕州窑办略趟胃附几砍只匣隧柑弗沫差嗽屏凑氟蚂诗务椭千扁铀瘁咋性巧弊励七旺碉阿悬茸猜娃率陈指馏捆蛙荆唯填鸡衍沾笋涩猜疤续仲氓准蛤浓茨孰冈叶侧酗聂施瓤啸埠惺帛沁瑶邀仇淳革匝瞄喇喘弛爵缩毕憋频挺执喀疡芜厦与兰苹亦谨颤畸践载泻牺仇坪柯几可选尊苗真罪宇褒匀昔瞻研弱讨图酉鲸袍祷智卤狮或垂炎军巧嫉强廓扶败椅澎荒衍铝灵蔫告鲜桶征喻谓鳖域冈叮鬼浇痔湾母霸田催艰佛并移入到E.coli内.经过五轮的突变与筛选,在每一轮中有106-107的突变株被测量,而筛选的严谨度可以藉由改变培养基中2-oxovaline的浓度,酵素的表现层次以及培养的.贴勤饼尽呜刁韧牌牢鹿来枯缘遣痰铺揪技瑰湖存左船辗汇侯击料砒祟堪挥编慕陡多雇夺竿碾涣英皱