阴离子双子表面活性剂与牛血清蛋白的相互作用研究毕业设计.docx

2015届毕业论文题 目 阴离子双子表面活性剂与牛血清蛋白的相互作用研究 专业班级 11级高分子材料与工程04班 学 号 1102020415 学生姓名 刘 明 指导教师 刘治田 指导教师职称 教 授 学院名称 材料科学与工程学院 完成日期： 2015 年 6 月 3 日阴离子双子表面活性剂与牛血清蛋白的相互作用研究Research on interactions between anionic Gemini surfactants and bovine serum albumin 学生姓名 指导教师 诚信承诺书本人郑重承诺：本篇毕业（设计）论文是在指导教师的指导下按照学校和学院有关规定完成的。毕业（设计）论文的内容没有剽窃、抄袭他人的研究成果，引用他人的观点和参考资料均已在文中以明确方式表明。毕业（设计）论文不存在篡改、伪造实验数据等行为。如有违规行为发生，我接受学校相关处理，并承担相应的责任。学生（签名）： 年 月 日武汉工程大学毕业论文摘 要蛋白质在表面活性剂溶液中可保持活性，二者构成的复配体系在食品、化妆品及生物技术等众多领域中都有着广泛的应用。关于蛋白质和传统表面活性剂相互作用的研究较为深入和系统，而双子表面活性剂和蛋白质的复配研究仍有很大的突破空间。本实验以壬基酚、二溴烷烃及氯磺酸为原料，合成了两种烷基苯磺酸盐型阴离子双子表面活性剂9BA-m-9BA(m=4, 6)，采用光谱法研究了其表面活性及其与牛血清蛋白的相互作用。研究表明，9BA-6-9BA比9BA-4-9BA的表面活性更高，其与牛血清蛋白的相互作用更加强烈。双子表面活性剂的加入一方面加大了酪氨酸和临近肽键及色氨酸之间的距离，使其荧光强度增大，另一方面则使色氨酸所处环境的微极性变小，致使其荧光强度降低。另外，研究发现，双子表面活性剂对牛血清蛋白的荧光猝灭机理中至少包含静态猝灭。关键词：双子表面活性剂；牛血清蛋白；相互作用；荧光AbstractProteins can remain active in the surfactant solutions and the complex system from their interaction has been widely used in fields like foods, cosmetics and biotechnology. Research on interactions between proteins and traditional surfactants has gained a lot deep and systemic results while the achievements on interactions between proteins and Gemini surfactants still have great space to breakthrough.In this study, two alkylbenzene sulfoate Gemini surfactants 9BA-m-9BA (m=4, 6) were synthesized with nonylphenol, dibromoalkanes and chlorosulfonic acid as main raw materials. Spectroscopy was used to determine their surface activity and their interactions with bovine serum albumin. It is found that 9BA-6-9BA was more surface active than 9BA-4-9BA and its interaction with bovine serum albumin is more intense. The introduction of the Gemini surfactant, on the one hand, enlarged the distance between the tyrosine residues and the neighboring peptide bonds as well as the tryptophan residues, leading to the increase of the BSA fluorescence intensity; On the other hand, improved the micropolarities of the environment around the tryptophan residues, causing the decrease of BSA fluorescent intensity. In addition, the study also found that Gemini surfactant led to the quenching of BSA fluorescence intensity and the quenching process contained static quenching mechanism at least. Keywords: Gemini surfactants; Bovine serum albumin; Interaction; Fluorescence目 录摘 要IAbstractIII第1章 文献综述11.1 Gemini表面活性剂概述11.2 Gemini表面活性剂的结构与性能21.2.1 Gemini表面活性剂的结构21.2.2 Gemini表面活性剂的性能31.3 Gemini表面活性剂的分类31.3.1 阳离子型Gemini表面活性剂31.3.2 阴离子型Gemini表面活性剂41.3.3 非离子型Gemini表面活性剂51.3.4 两性离子型Gemini表面活性剂61.4 Gemini表面活性剂的应用71.4.1 洗涤剂71.4.2 抗静电剂71.4.3 生物技术71.4.4 金属防腐剂81.4.5 化学驱三次采油81.5 Gemini表面活性剂与蛋白质的相互作用91.5.1 表面活性剂与蛋白质的相互作用研究概况91.5.2 阴离子表面活性剂与蛋白质的相互作用91.5.3 表面活性剂与蛋白质相互作用的研究方法101.6 论文的研究背景和研究内容10第2章 实验部分132.1 实验药品与试剂132.2 实验仪器与设备142.3 烷基苯磺酸盐型Gemini表面活性剂9BA-m-9BA的合成142.3.1 实验合成路线142.3.2 合成中间体二醚142.3.3 合成9BA-m-9BA152.4 Gemini表面活性剂9BA-m-9BA与BSA的相互作用152.4.1 芘探针荧光光谱的测定152.4.2 同步荧光的测定162.4.3 内源荧光的测定162.4.4 紫外吸收光谱的测定16第3章 结果与讨论173.1 芘探针荧光光谱173.2 同步荧光183.3 内源荧光193.4 紫外吸收光谱21第4章 结论与建议234.1 结论234.2 建议23参考文献25致 谢29VI第1章 文献综述1.1 Gemini表面活性剂概述Gemini表面活性剂，是通过一个联接基团将两个相同或几乎相同的传统表面活性剂单体在其亲水头基或亲水头基附近连接在一起而形成的一类新型表面活性剂。其独特的结构、优良的性质和广泛的应用空间，吸引着越来越多研究者投身于Gemini表面活性剂的研究领域中。上个世纪70年代至今，Gemini表面活性剂的研究工作已取得了重大进展。1971年，Bunton等1在Gemini表面活性剂这一领域迈出了历史性的一步，合成了第一个阳离子型Gemini表面活性剂。1974年，Deinega等2探索并合成了一族新型双亲分子。此时，Gemini表面活性剂仍没有引起广大研究者们足够的重视。1990年后，Zhu等3-4合成并研究了一系列具有柔性联接基团的双烷基链Gemini表面活性剂。而此时，这类新型的表面活性剂仍然没有统一的命名。1991年，Menger5合成并研究了联接基为刚性基团的双烷烃链表面活性剂，并称该类型的表面活性剂为：Gemini surfactants。运用Gemini在天文学上的意义生动而形象地表现了这一新型表面活性剂的分子结构特点。随后，“Gemini”这一命名被广大的研究者所接受并采纳。1991之年，Rosen等6系统地合成了通过氧乙烯和氧丙烯联接的Gemini表面活性剂，并进行了深入的研究。同期，法国Zana小组对一系列季铵盐型Gemini表面活性剂的研究亦取得了重大的成果7-13。众多研究成果表明，Gemini的表面活性比相应的传统表面活性剂要高很多。国外在双子表面活性剂这一领域的研究工作起步较早，而且研究范围广泛，研究内容系统；以法国的Zana研究组、美国的Rosen研究组以及日本的Nakatauji研究组等为代表。我国对于Gemini表面活性剂的研究起步较晚，因此与国外存在一定的差距。目前，国内从事表面活性剂领域研究工作的小组主要有福州大学的赵剑曦小组，北京大学的黄建滨小组，中科院化学所的王毅琳小组等，并取得了比较大的成就。1.2 Gemini表面活性剂的结构与性能1.2.1 Gemini表面活性剂的结构Gemini表面活性剂含有两个亲油基、两个亲水基和一个联接基团。其结构如图1所示。图1.2 Gemini表面活性剂的结构示意图A1, A2亲水基；S联接基团；R1, R2疏水基联接基团可以变化，其长度、化学结构和性质均可不同。既可以是支链，也可以是直链；有刚性的，也有柔性的；能疏水，亦能亲水。显然，不同亲水基、疏水基和联接基的组合意味着结构各异、种类各异的Gemini表面活性剂；而且，通过对这些基团加以修饰，便可改善Gemini表面活性剂的性质及性能。例如：联结基团的种类和长度极大地影响其CMC值。刚性、疏水意味着高CMC值；而柔性、亲水则恰好反之。依亲水基的性质，Gemini表面活性剂分为阳离子、阴离子、非离子和两性离子型四类。目前，阳离子Gemini表面活性剂的研究工作已经相当深入，这主要归因于其合成及纯化过程相对容易；而其他三种类型的Gemini表面活性剂的研究还有很大的空间有待突破。阴离子型Gemini表面活性剂方面，磷酸盐、羧酸盐、硫酸盐和磺酸盐四种主要类型的研究已取得很多重大成果。非离子表面活性剂主要为醇醚、酚醚类和糖类衍生物，而关于两性离子型Gemini表面活性剂的研究成果则鲜有报导。Gemini表面活性剂的结构对性能有很大影响，关于这一点，已取得了较为深入的研究。1.2.2 Gemini表面活性剂的性能Gemini表面活性剂的联接基以化学键的形式将两个离子头基紧密连接在一起。这拉近了两个疏水基之间的距离，使疏水相互作用大大加强；而且，因为化学键的关系，离子头基间的相互排斥被大大削弱。这解释了为什么Gemini表面活性剂具有更高的表面活性14。目前，由于合成、分离及纯化等各方面的不同，各类型的Gemini表面活性的研究状况表现出较大的差距。阳离子型Gemini表面活性剂的研究最为深入，阴离子型Gemini表面活性剂的研究相对少很多，而两性及非离子型Gemini表面活性剂的研究则更少。据研究，离子型Gemini表面活性剂具有如下几大重要特性：(1)更易聚集生成胶束；(2)具有优良的钙皂分散特性；(3)在许多应用方面，是优良的润湿剂；(4)降低水溶液表面张力的效率非常突出；(5)更易吸附在气/液表面，从而更有效地降低水溶液的表面张力；(6)衡量离子型表面活性剂水溶性的Kraff点(TK越低，水溶性越好)很低； (7)可与传统的非离子表面活性剂、蛋白质及水溶性聚合物等复配，表现出优良的性质，在众多领域具有重大的应用价值。1.3 Gemini表面活性剂的分类1.3.1 阳离子型Gemini表面活性剂阳离子型Gemini表面活性剂主要有季铵盐型、酰胺盐型和杂环型三类。其中，研究的最为系统和深入的为季铵盐型Gemini表面活性剂。陈功等15以壬基酚为原料先后与甲醛、环氧氯丙烷及三乙醇胺反应制得一种季铵盐Gemini表面活性剂。实验测定了其CMC值及CMC下的表面张力，与传统表面活性剂进行了比较。结果表明，该表面活性剂的CMC比传统表面活性剂低12个数量级，而相应的表面张力则比较接近。该表面活性剂的结构如下：Eastoe等16合成了一种新型季铵盐Gemini表面活性剂，研究了其在水中的光反应、界面性质及聚集态变化。该表面活性剂引起了许多研究者的兴趣，因为其联接基团为对称二苯代乙烯发色团。其结构如下：Tehrani-Bagha等17合成了一种联接基团可降解的季铵盐Gemini表面活性剂。据其结构特点，简称为12Q2OCO1Q12，Q代表季铵基，数字表示亚甲基或甲基的数目。测定了其临界胶束浓度，并深入研究了其化学水解、生物降解过程及其毒性。与其两种水解产物相比，该季铵盐Gemini表面活性在CMC处具有最低的表面张力。由于相邻两个季铵基的邻近作用，其分子中的酯键在酸性一侧非常稳定，而在微弱的碱性条件下则变得极不稳定；因此，可通过调节pH控制其水解过程。实验证明，其28天后其生物降解率超过60%，可归为快速生物降解类。该Gemini表面活性剂已被证实对水生生物有毒(ErC50值为0.27mg/L)，尽管其毒性比其水解产物低。1.3.2 阴离子型Gemini表面活性剂阴离子型Gemini表面活性剂主要有羧酸盐型，磷酸盐型，硫酸盐型和磺酸盐型四类，并且关于其合成方法的研究也较为深入。Renouf等18合成了一系列烷基磺酸盐Gemini表面活性剂，采用了两种不同的方法测定了其表面张力及CMC值，并与相应的传统表面活性剂进行了比较。同时，研究并发现了，联接基团长度的增加将导致该类表面活性剂的CMC值降低。其中一种表面活性剂的结构如下：Menger等19合成了两个系列的磷酸盐型Gemini表面活性剂，并测定了其表面张力与浓度的关系，系统研究了其疏水尾链的长度对其表面活性的影响。其中一个系列的表面活性剂的联接基团为对二苯代乙烯基，其结构如下：1.3.3 非离子型Gemini表面活性剂非离子型Gemini表面活性剂只有两类，即醇醚、酚醚型和糖类衍生物，后者主要有烷基糖苷型和糖基酰胺型。糖类衍生物具有环保上的优势，其原料可再生、产品易生物分解，符合当前的环保体制，因此受到优先关注。Tracy等20以月桂酸为原料合成了酚醚型非离子Gemini表面活性剂，其合成路线如下：此外，Tracy在非离子型Gemini表面活性剂这一领域取得了丰富的研究成果。其合成的非离子型Gemini表面活性剂数量和系列众多，并进行了深入地探索和研究，取得了重大的进展，为这一领域的研究者提供了很多具有重大价值的参考，以下两种分子即为Tracy合成。1.3.4 两性离子型Gemini表面活性剂两性离子型Gemini表面活性剂主要有：氨基酸型、甜菜碱型、咪唑啉型等。蒋惠亮等21以N,N-二羟乙基乙二胺、氯乙酸钠及硬酯酰氯为原料合成了一种氨基酸型两性离子Gemini表面活性剂。其结构如下：关于两性离子型Gemini表面活性剂研究相对较少，该方面的报导也不多。现简要列举两种两性离子型Gemini表面活性剂分子如下： 1.4 Gemini表面活性剂的应用1.4.1 洗涤剂Gemini表面活性剂的CMC值更低，具有更高的表面活性；因此，其溶液中未胶束化的部分浓度较低。基于此，在降低毒性，减轻刺激性和溶解非水溶性物质方面，Gemini表面活性剂表现出优越性；而且，Gemini表面活性剂的起泡、分散和乳化性能更佳，对高浓度洗涤剂的配制意义重大。研究发现，由普通表面活性剂、Gemini表面活性剂和非离子聚合物所制成的洗涤剂，不但具有促进污物沉降、提高洗涤能力的效果，而且还具有更强的溶解能力，即使该配方中Gemini表面活性剂的浓度非常低。当前，由于价格昂贵，Gemini表面活性剂在洗涤剂工业未能得到大规模应用。但其与传统表面活性剂复配使用，也表现出很强的洗涤效果，这在工业中已经得到了一定的发展和应用。1.4.2 抗静电剂研究发现，当Gemini表面活性剂分子吸附在纤维界面时，其亲油基指向纤维，亲水基则背离纤维。基于这一点，纤维的离子和吸湿导电性能明显增强。因为Gemini表面活性剂分子吸附到纤维界面后产生了放电现象，致使纤维表面的电阻降低；这使纤维静电的产生与释放达到平衡，从而防止了纤维的静电积累，达到抗静电的目的。显然，Gemini表面活性剂具有更多的亲水、亲油基团。这意味着其作为抗静电剂时，将比传统的表面活性剂具有更好的效果。1.4.3 生物技术酶是具有生物活性的一类蛋白质，在生物体内扮演着至关重要的角色。当前，于医药合成方面，酶的作用日益突出，酶制剂在临床上的应用价值也正受到越来越多研究者们的关注；但其分离、纯化及其稳定性方面的问题仍亟待解决。Gemini表面活性剂在有机相中将自发形成反相胶束，利用这一点，可在一定条件下将水溶蛋白质提取至反向胶束的极性核中，然后再创造条件将其提取至另一水相，从而实现蛋白质转移并达到分离和提纯的目的。这种方法的优势明显：酶不与有机相直接接触，失活几率大大降低。另外，采用Gemini表面活性剂与相关物质构成的微乳液体系可同时包裹酶和底物，模拟酶在细胞中的功能。因此，Gemini表面活性剂在生物技术领域具有广阔的应用前景。1.4.4 金属防腐剂由于金属表面大多带有电荷，Gemini表面活性剂的两个极性亲水基将通过物理或化学作用吸附到金属表面。在吸附过程中，亲水基靠近金属表面，亲油基则远离金属表面。表面活性剂的亲水性和亲油性对其吸附力和分散性影响很大。亲水性较强时，表面活性剂对金属具有较强的吸附力，但此时的分散性较差；亲油性较强时，则情况恰好相反。因此，表面活性剂的亲水亲油值(HLB值)应视具体情况而选择。表面活性剂吸附在金属表面上时，界面性质和金属表面的电荷分布状态都将发生改变。这使得金属表面的能量状态趋于稳定，腐蚀反应所需活化能升高，即能量障碍增加，从而导致腐蚀速率减慢。与此同时，已吸附到金属表面上的表面活性剂分子的亲油基形成一层疏水性保护膜，起到阻碍与腐蚀反应相关的电荷及物质的移动，从而进一步降低了腐蚀反应的速率。譬如，原油中含有大量杂质，其在储存过程中会对设备造成严重腐蚀。加入少量羟基乙叉二膦酸即可在很大程度上减轻原油对存储设备的腐蚀。1.4.5 化学驱三次采油在化学驱三次采油作业中，驱油方式主要有三种。表面活性剂单独或与聚合物一起使用，表面活性剂与碱以及聚合物一起使用。上述三种驱油方式中，表面活性剂用于降低油水界面张力；聚合物可提高注入流体的粘度，从而改善油水流度比；碱可与原油中的酸、酯类活性组分反应生成新的表面活性剂，达到进一步降低界面张力的效果。总之，在三次采油作业中，Gemini表面活性剂具有巨大的应用潜力： (1)增溶等量原油时，所需Gemini表面活性剂浓度要低得多；(2)与其他驱油助剂有更好的配伍性，可降低实际应用成本；(3)在较低浓度下即达到超低界面张力，对驱油效率的大幅度提高意义重大；(4)具有更好的水溶性和耐盐性。1.5 Gemini表面活性剂与蛋白质的相互作用1.5.1 表面活性剂与蛋白质的相互作用研究概况研究发现，蛋白质在表面活性剂溶液中可保持活性，二者的混合体系 (Protein-Surfactant, P-S)在众多领域中发挥着广泛而重要的应用，二者相互作用的特性也吸引着越来越多研究者的关注及探索。表面活性剂的加入可提高某些蛋白质的热稳定性，据此可优化相关的蛋白质产品。在蛋白质的提取和纯化中，表面活性剂的引入也将极大地提高效率。表面活性剂作为变性剂时，可用于蛋白质的自组装和稳定性的研究；其作为探针分子，则可用于蛋白质的结构和功能方面的研究。研究表明，表面活性剂的种类、浓度和环境对P-S体系都有着重大的影响；二者之间主要存在着静电作用和疏水作用。离子型表面活性剂与蛋白质作用时，主要是极性基的静电作用和疏水碳氢链的疏水作用，分别结合到蛋白质的极性和疏水部分，形成P-S复合物。在P-S体系中，关于蛋白质-阴离子表面活性剂体系的研究最多。因为这二者之间的相互作用最强，而其他类型的P-S体系中，二者的相互作用相对要弱很多。1.5.2 阴离子表面活性剂与蛋白质的相互作用阴离子型表面活性剂与蛋白质之间有着相对较强的相互作用，其离子头基静电作用较强，结合到蛋白质表面带相反电荷的基团上，非极性基团则通过疏水作用结合到蛋白质非极性区域。二者相互作用依赖蛋白质表面的电荷、阴离子型表面活性剂的浓度和结构等；其中，蛋白质表面的电荷影响最大。在蛋白质-阴离子表面活性剂(Protein-Anionic Surfactant, P-AS)体系中，二者的相互作用以静电作用和疏水作用为主要驱动力；静电作用表现为静电吸引或静电排斥，与蛋白质的表面电荷密切相关，疏水作用一般与疏水链的长度有关。十二烷基硫酸钠(SDS)的化学性质稳定，在酸性或碱性介质中以及加热条件下都不发生分解；而牛血清蛋白(BSA)来源广泛、易于分离，与人血清蛋白结构相似，且具有良好的水溶性、稳定性。因此，关于二者相互作用的研究引起了很多研究者的兴趣并取得了一系列重大成果。 Kelly等22研究发现：固定BSA不变，逐渐增加SDS，当SDS/BSA较小时，SDS可为BSA的结构稳定剂，当SDS浓度提高到一定浓度时，BSA完全变性，Moriyama等23则证实了这一结果。1.5.3 表面活性剂与蛋白质相互作用的研究方法构成蛋白质的20余种氨基酸中，色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)残基的生色团在280nm波长附近有一个吸收峰，苯丙氨酸(Phe)残基的生色团在257nm波长附近有一个吸收峰；此外，肽键在225nm波长附近对光的强烈吸收也给出一个特征吸收峰。所以，蛋白质能产生紫外吸收光谱。表面活性剂地加入，将导致蛋白质生色基团紫外吸收光谱发生变化。因此，可通过紫外吸收光谱研究P-S体系中这几种氨基酸残基微环境的变化，进而推断二者的相互作用情况。上述三种残基能吸收270300nm的紫外光而发出紫外荧光。Trp、Tyr和Phe的荧光峰分别位于348、303和282nm；其中，Trp的荧光强度最大，Tyr次之，Phe的荧光强度可忽略。因此，蛋白质的内源荧光主要是由Trp和Tyr残基所发射。表面活性剂地加入，会导致蛋白质荧光的猝灭。所以，可利用荧光光谱法研究表面活性剂与蛋白质的相互作用。此外，圆二色光谱和电子自旋共振光谱技术也广泛应用于P-S体系的研究。1.6 论文的研究背景和研究内容目前，关于阳离子表面活性剂性能与结构的研究，已经取得了比较系统的成果；相比之下，阴离子表面活性剂则由于合成路线通常较长，分离提纯困难等原因而研究得相对较少。传统的烷基苯磺酸盐表面活性剂发泡性能优良、去污能力强、耐盐性和分散性好，使其在众多领域中得到了广泛应用；而烷基苯磺酸盐Gemini表面活性剂各方面的性能都有了很大的提高，其应用前景更加广阔。因此，有必要对烷基苯磺酸盐Gemini表面活性剂进行深入研究，揭示其结构与性能之间的关系，从而为其应用奠定更加坚实的基础。此外，表面活性剂和蛋白质的复配在众多领域都有着广泛的应用，因此研究二者之间的相互作用也显得十分重要。本文中，我们合成了两种烷基苯磺酸盐阴离子Gemini表面活性剂，运用光谱法研究了其表面活性及其与牛血清蛋白的相互作用。而且，在二者相互作用的过程中，考察了联接基团的长度对BSA荧光强度的影响，这也是本论文的创新点。第2章 实验部分2.1 实验药品与试剂表2.1 实验药品与试剂试剂名称级别生产厂家壬基酚99%西亚试剂四丁基溴化铵99%武汉格奥化学技术有限公司1,4-二溴丁烷98%武汉格奥化学技术有限公司1,6-二溴己烷98%武汉格奥化学技术有限公司氢氧化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司无水乙醚分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司蒸馏水分析纯武汉格奥化学技术有限公司冰乙酸分析纯天津市博迪化工股份有限公司无水硫酸镁分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司石油醚分析纯武汉格奥化学技术有限公司乙酸乙酯分析纯武汉格奥化学技术有限公司二氧化硅分析纯国药集团化学试剂有限公司氯磺酸分析纯武汉格奥化学技术有限公司二氯甲烷分析纯武汉格奥化学技术有限公司氮气化学纯武汉市同和气体制造有限公司无水乙醇分析纯天津市富宇精细化工有限公司芘分析纯武汉格奥化学技术有限公司丙酮分析纯天津市富宇精细化工有限公司牛血清蛋白 99.0%国药集团化学试剂有限公司无水磷酸二氢钠分析纯武汉格奥化学技术有限公司十二水合磷酸氢二钠分析纯武汉格奥化学技术有限公司2.2 实验仪器与设备表2.2 实验仪器与设备设备名称生产厂家智能恒温磁力搅拌器武汉科尔仪器设备有限公司循环水式真空泵巩义市予华仪器有限公司旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司电子天平赛多利斯科学仪器(北京)有限公司荧光分光光度计安捷伦科技有限公司紫外分光光度计珀金埃尔默股份有限公司2.3 烷基苯磺酸盐型Gemini表面活性剂9BA-m-9BA的合成2.3.1 实验合成路线2.3.2 合成中间体二醚(1)向100mL烧瓶中加入12.12g(55mmol)壬基酚和1g四丁基溴化铵，然后加入50g质量分数为20%的氢氧化钠水溶液，磁力搅拌。(2)升温至70后，加入25mmol 1,4-二溴丁烷或1,6-二溴己烷，继续升温至95，搅拌过夜。(3)反应结束后冷却至室温，用30mL无水乙醚萃取3次；再用冰醋酸调pH至中性，然后用30mL蒸馏水洗涤三次；加无水硫酸镁干燥，过夜。(4)减压抽滤，蒸干溶剂，得二醚(粗产物)。(5)利用柱层析法精制二醚，淋洗剂为石油醚和乙酸乙酯(极性控制为石油醚：乙酸乙酯=15：1)。m=4时，产率为80.97%；m=6时，产率为77.43%。2.3.3 合成9BA-m-9BA (1)向50mL三口烧瓶中加入二醚2.40g(5mmol)，并加入15mL无水二氯甲烷作为溶剂，磁力搅拌。(2)接HCl尾气吸收装置，先通氮气15min，然后在冰水浴条件下将溶于15mL无水二氯甲烷的1.28g(11mmol)氯磺酸，于1h内滴入反应体系，反应过夜。(3)反应结束后，通氮气吹出气体至尾气吸收处不再产生白烟，用5%的氢氧化钠的乙醇溶液中和至pH=8，静置过夜。(4)减压抽滤，得粗产物；用无水乙醇重结晶3次得白色固体。(5)所得产物用油泵抽干。m=4时，产率为51.47%；m=6时，产率为47.56%。2.4 Gemini表面活性剂9BA-m-9BA与BSA的相互作用本文中若无特别说明，所用溶液均由磷酸缓冲液(pH=7.4)配制而成。为表述方便，分别以Gemini I、Gemini II代指表面活性剂9BA-4-9BA、9BA-6-9BA。2.4.1 芘探针荧光光谱的测定(1)于20、5mL的容量瓶中配制10-3mol/L的芘溶液(以丙酮为溶剂)。(2)取两支10mL的比色管，配制10-3mol/L的两种Gemini溶液。用移液管移取5mL Gemini溶液于另一支10mL的比色管中，加蒸馏水稀释至刻度线处。依此方法稀释，配制一系列浓度不同的两种Gemini溶液。(2)用微量进样器向每个比色管中注射5L芘的丙酮溶液，然后置于超声浴中震荡1h。(3)在荧光分光光度计中测定每个比色管中芘的荧光发射光谱。固定激发波长为335nm，扫面范围为350450nm，激发狭缝宽度为10nm，发射狭缝宽度为2.5nm，测试温度约25。因为丙酮的加入量极少，故其对测定结果的影响可以忽略不计。2.4.2 同步荧光的测定(1)取10mL的比色管一支，配制10-5mol/L的BSA的溶液；取20、10mL的容量瓶两只，配制10-3mol/L的两种Gemini溶液。(2)移取3mL的BSA溶液于5mL的石英比色皿中，将比色皿置于荧光分光光度计中，恒温一段时间。固定为20nm，扫描范围200450nm，激发与发射狭缝宽度分别为15nm和5nm；扫描BSA的同步荧光光谱。(3)用微量进样器向比色皿中注射Gemini I溶液，每次5L，每次加入表面活性剂后，做一次同步荧光光谱扫描，测试温度为25。(4)同法测定加入Gemini II时BSA的同步荧光光谱。多余的Gemini溶液用于内源荧光的测定。2.4.3 内源荧光的测定(1)取10mL的比色管一支，配制10-5mol/L的BSA的溶液。(2)移取3mL BSA溶液于5mL石英比色皿中，将比色皿置于荧光分光光度计中，恒温一段时间。固定激发波长280nm，扫描范围290450nm，激发与发射狭缝宽度分别为15nm和5nm；扫描BSA的内源荧光光谱。(3)用微量进样器向比色皿中注射Gemini I溶液，每次5L，每次加入表面活性剂后，记录BSA的内源荧光光谱，测试温度约25。(4)同法测定加入Gemini II时BSA的内源荧光光谱。2.4.4 紫外吸收光谱的测定(1)固定BSA的浓度为10-6mol/L，配制Gemini/BSA摩尔比为0:1，1:1和2:1的混合液。(2)以相应浓度的Gemini溶液为空白组，在200400nm范围内扫描其紫外吸收光谱，狭缝宽度0.5nm，测试温度约25。第3章 结果与讨论3.1 芘探针荧光光谱芘的荧光发射光谱在373, 379, 384, 394以及480nm附近共有5个荧光峰。表面活性剂对芘有增溶作用，增溶能力与其浓度有关，当超过临界胶束浓度CMC时，增溶能力会发生突变。与此同时，I1/I3(373nm附近与384nm附近的荧光峰强度之比)随浓度的变化曲线也将发生突变，曲线突变的中点即为表面活性剂的CMC。因此，可先测定不同浓度Gemini溶液中芘的荧光光谱，再导出实验数据，以I1/I3对Gemini的浓度作图即可确定相应表面活性剂的CMC，从而可以比较Gemini I、Gemini II的表面活性。图3.1 芘的荧光峰强度I1/I3随Gemini的变化I1/I3与芘所处微环境的极性有关，极性越大，则I1/I3越大。图3.1显示了芘的荧光峰强度I1/I3随Gemini表面活性剂浓度的变化。由图可以看出，当Gemini表面活性剂浓度较低时，I1/I3几乎保持不变；继续增大Gemini的浓度，曲线发生突变；当Gemini达到较高浓度后，I1/I3又趋于一个稳定值。Gemini表面活性剂浓度较低时，芘周围的微极性主要受水影响；因此，I1/I3基本没有变化。当Gemini浓度达到CMC时，体系中开始形成胶束，部分芘开始增溶到表面活性剂所形成的自由胶束中，使得芘周围环境的微极性突然变小，从而导致I1/I3发生突变。随着Gemini浓度进一步增大，体系中不断生成新的胶束；因此，越来越多的芘将增溶到表面活性剂形成的自由胶束中。当Gemini达到一定浓度后，芘全部转移到胶束中，其所处环境的微极性不再变化，I1/I3趋于稳定。从图3.1可以很清楚地观察到，Gemini II对应的曲线在更低的浓度时即发生突变，并在Gemini I所对应的曲线之前开始趋于稳定。曲线突变处的中点浓度即为CMC，显然，Gemini II的CMC更低。这说明Gemini表面活性剂9BA-6-9BA比9BA-4-9BA的表面活性更高。这可能是由于9BA-6-9BA的联接基团更长，两个亲水头基的间距更大，亲水性减小所致。3.2 同步荧光蛋白质的荧光主要由Trp和Tyr两个残基所发射，而同步荧光可以分别解析Trp和Tyr的特征光谱。研究发现，当=20nm或60nm时，BSA的同步荧光分别显示Trp、Tyr残基的光谱特性。两种残基中，Tyr的荧光能被邻近的肽键猝灭，且其部分能量会转移到Trp上，所以Tyr的荧光量子产率很低。本实验固定激发和发射波长差=20nm，解析了BSA上Tyr残基的光谱特性。图3.2 BSA的同步荧光随Gemini的变化图3.2显示了BSA的同步荧光随Gemini表面活性剂浓度的变化规律。图中，箭头所指方向表示Gemini浓度增大。两图中各有六条曲线，Gemini I对应的光谱中，前三条曲线几乎完全重合。但从总体上看，BSA的荧光强度在Gemini I和Gemini II的浓度变化一致的条件下具有相同的变化趋势。现主要以Gemini II为例对曲线进行分析。加入表面活性剂Gemini II之后，Tyr残基的荧光强度立刻发生变化；并且，随着Gemini II浓度的增加，其荧光强度不断增大。这说明Gemini II与BSA相互作用，可能导致BSA的结构变得疏松，从而加大了Tyr和临近的肽键及Trp残基之间的距离，使得肽键的猝灭影响减小，两种残基间的能量转移效率降低。因此，Tyr的荧光强度得到很大的恢复。Gemini II在浓度更低的情况下，便使Tyr的荧光强度开始增加，说明其与BSA的相互作用更加强烈。3.3 内源荧光BSA主要含有Trp、Tyr及Phe三种荧光残基，而Phe的荧光量子产率很低，可忽略不计；因此，BSA的内源荧光主要来自Trp和Tyr这两种残基的贡献。图3.3 BSA的内源荧光光谱随Gemini的变化图3.3显示了BSA的内源荧光光谱随Gemini表面活性剂浓度的变化规律。图中，箭头所指方向表示Gemini浓度增大。由图3.3可知，BSA荧光强度在 Gemini I和Gemini II的浓度变化一致的条件下具有相同的变化趋势。现主要以Gemini I为例对曲线进行分析。加入表面活性剂Gemini I后，BSA的荧光强度立刻降低；随着Gemini I浓度的增大，BSA的荧光强度继续减小且光谱峰蓝移；当Gemini I的浓度增大到一定程度时，光谱峰蓝移的同时BSA的荧光强度又开始增大。结合BSA同步荧光的测定结果可知，这主要是由于Trp残基的荧光强度减小所致。据研究，Trp残基的荧光发射光谱对其所处环境的微极性非常敏感，微极性越低，其荧光量子产率越小。加入表面活性剂Gemini I后，BSA荧光强度的降低和光谱峰的蓝移都反应了BSA的构象变化，即二者相互作用使Trp残基暴露在更加疏水的环境中。据此可以推测，Gemini I的疏水尾链和BSA的Trp残基发生了疏水相互作用导致其周围环境的微极性降低。另外，BSA的内源荧光最后又开始增大，这应该是由Tyr残基荧光强度增大所致(同步荧光的测定结果证实了这一点)。从图3.3还可以看出，在Gemini浓度变化一致的条件下，加入Gemini II比加入Gemini I的BSA荧光光谱峰蓝移更加明显，说明Gemini II与BSA的作用更加强烈，这也从侧面证明了Gemini II比Gemini I的表面活性更高。3.4 紫外吸收光谱显然，Gemini表面活性剂的加入导致BSA的荧光强度减小，产生了荧光猝灭现象。基态荧光物质与猝灭剂形成不发光的配合物或者激发态的荧光物质和猝灭剂碰撞而导致能量转移都将使荧光强度降低；前后两种猝灭机理分别称为静态猝灭和动态猝灭。本实验中，我们固定BSA的浓度不变，研究了不同Gemini/BSA摩尔比条件下的BSA的紫外吸收光谱。两种不同Gemini表面活性剂所得到的图谱几乎完全相同，故只给出Gemini II所对应的图谱并以之为例进行分析。图3.4 不同Gemini II/BSA的紫外吸收光谱图中前后两个吸收峰分别对应肽键和芳香残基的紫外吸收，加入Gemini II后，两种基团的紫外吸收均有所降低。这说明Gemini II和BSA形成了复合物，致使肽键和芳香残基的环境发生改变，从而导致其紫外吸收特性发生改变。由此可以推断，Gemini表面活性剂对BSA的荧光猝灭机理中包含静态猝灭过程。由于实验条件及进度安排等方面的原因，关于动态猝灭方面的测试未能付诸实践。第4章 结论与建议4.1 结论(1)实验合成的两种Gemini表面活性剂中，9BA-6-9BA比9BA-4-9BA的表面活性更高，其与BSA的相互作用更加强烈。(2)Gemini与BSA相互作用，一方面使Trp所处环境的微极性减小，致使其荧光强度降低，光谱峰蓝移；另一方面又加大Tyr和临近的肽键及Trp之间的距离，使肽键的猝灭影响减小、两种氨基酸残基间的能量转移效率降低，Tyr的荧光强度有较大的恢复。(3)Gemini表面活性剂9BA-m-9BA对BSA的荧光猝灭机理中至少包含静态猝灭过程。4.2 建议本实验中，Gemini表面活性剂9BA-m-9BA(m=4, 6)为实验室自制，其合成、分离及纯化过程有一定的难度。许多细节若不加以重视，将很有可能导致实验失败，从而严重影响到毕业设计后续实验的进展。笔者根据实验经历，就Gemini表面活性剂的合成这一方面提出以下建议：(1)Gemini表面活性剂合成的第二步中，二氯甲烷一定要除水，最好即蒸即用，以免氯磺酸与水反应而导致产率降低甚至实验失败。(2)粗产物的重结晶过程，控制好无水乙醇的用量，尽量提高Gemini表面活性剂的产率。(3)每一步反应完成后，及时取样与原料一起点板，确定反应是否发生。(4)已合成出来的中间体二醚，最好不要一次性用完，若第二步出现问题，待分析原因、改进实验方案后便可不必重头开始。关于测试方面，主要应该注意测试前的准备及相关参数的设定。测试过程比较繁琐，但整个过程都要求实验人员全身心地投入到其中。参考文献1 Bunton C A, Robinson L B, Schaak J, et al. Catalysis of nucleophilic substitutions by micelles of dicationic detergentsJ. The Journal of Organic Chemistry, 1971, 36(16): 2346-2350.2 Deinega Y. ZR UI berg, LG Marochko, VP Rudi, VP Deni-senkoJ. Zh. Kolloidn, 1974, 36: 649.3 Zhu Y, Masuyama A, Okahara M. Preparation and surface-active properties of new amphipathic compounds with two phosphate groups and two long-chain alkyl groupsJ. Journal of the American Oil Chemists Society, 1991, 68(4): 268-271.4 Zhu Y, Masuyama A, Kirito Y, et al. Preparation and properties of double-or triple-chain surfactants with two sulfonate groups derived from N-AcyldiethanolaminesJ. Journal of the American Oil Chemists Society, 1991, 68(7): 539-543. 5 Menger F M, Littau C A. Gemini-surfactants: synthesis and propertiesJ. Journal of the American chemical society, 1991, 113(4): 1451-1452. 6 Rosen M J. Geminis: A new generation of surfactants: these materials have better properties than conventional ionic surfactants as well as positive synergistic effects with non-ionicsJ. Chemtech, 1993, 23(3): 30-33.7 Zana R, Benrraou M, Rueff R. Alkanediyl-. alpha.,. omega.-bis (dimethylalkylammo