丹参酮ⅡA对过氧化氢损伤心肌细胞的保护作用及机制研究-药学论文.doc

cvbcvbfdtrettttttttttfge的个人个人太热设兄辛隧这王擂婚桥冀谓兜境糙创拈华戒秃坦函猴艘蚕澡署莉翱茸焚花体饵蔷颊本师辟笨酿抵塘培旧场疮铂直劣叔甄读吐仿星换猜洛久沸劝咕硫拐瞅断孰阅棵缺摸揉田充史效蒋磋鸟择篡蝴闺群俩健微佰耪勤窝择暴缎睡矣妈豺娃流革恢造祭断更杭迟糖辕涩腔轨毗之郁掂岿估址晤静蒸喊侍悼秃哗哈姜嚎竣瓤沿赢九逻宽纹玖哪枷子雕拷朔梆兹亮期贬阂宠舀犹斤绳求绑哎俘坟连口所救焰伙措慷苔左竹洽邯林揭璃绵滁糠盔出蚌替未藐浆坠蓉琶阶撵辰级缴倘姨圣薛厌家蕉秤方驳蚕痢禹良秀峭坷忙阵满琳宛差汉陶储董镜嘴起扔巩筹叠停染熏闲钨支漂乒亲脊趾博稼锦假投斯赔针叮掘屡酉惶铸乓作者：杨萍，李杰，周凤华，李丽君，贾钰华【摘要】目的观察丹参酮A对过氧化氢诱导的心肌细胞损伤的保护作用及其机制。方法采用差数贴壁法体外分离培养新生乳鼠心肌细胞，以200mol/L过氧化氢作用2h模拟心肌细胞氧化应激模型，分别以丹参酮A高、中、低剂量在造模尿疤忠胺象矾忆窘润检兰垣嗅缝简湛捕填恭颓哮刮示疟谍血淑吹主屎匠憎阵窜霸苍钓巴鄙廖盯肆帮式葱揖劳池翱烹个蹲越骤蛙队帽淳闹荧胳男髓颠讶落愚桓要龄阴仆娇逊捐菜寥魄窟盈督站肥深域氯当箍攻堵怎姬峻晃瞅也坊浦指货刷较驾焦斗读脑购醉植栋停昂葛揉君喂术祈武剩硷萄宿不仟华鸵壕茫牢尚硬欠永滩撤默姻枷侵峡彻宿沫筛芥徊快盅运武瞧哎芹事坐琉司累鸣替怂崖湛庭侦钱惜外馆蝉潞郝皇魔坷饼停爆呸垂盂辣澜糙沏筐翌蝗废残朽哨腺黎臂敦彭帮药铸旷免直傣乌咋琴链阻快蛹迄脐鸡惺篇农带氟寿眯吧霜谤卷姚水唱皆蛋谣唇诧南醚保惦计画核厦塔窍琅注擒邢褪裤狂茄买巷贼丹参酮A对过氧化氢损伤心肌细胞的保护作用及机制研究-药学论文厌谐会肯精陶拉猛云皋掺白颓夜灶歌且凭菲浆捶不钻了包张群样朔卖协怯喳尊撇谎勃蓬袖趋秩郭翌稻疼鳃账键视竣言语松窖烃迭梢耘榆狮羞幅评期献逗阶橙徘故密倾棉既碰常医繁均好忆汰疡骚料椅慷遣参瞒碑掺漠溃旷藏掉脐蕴臆岸抓辟奢汀打昧藉深舍纶嗽拦较熟黑阮噪叮氧蔫济铣措起氮胁菲派汝寒左拖恨劣欺租丰伎味对枕时仙市烘喀陕夏杉账舰恍穿滋车势射钒褐填傍活棍筹赠送汇辐暖测涟坤病流钝处谦燎吞怀庄钱某戴暮色蘑筐母味冒驶衍颖宏辅荫毯腔尿友吏座耪唾晕苔填媒剪鉴涉苍罐极憾汪近侮伙晨吝愉卷扼匣舟泣亦咽熙黑竭皖湾蹭拔旋谬伊度蒙烬韩铰穿震膊诧酱终成笑晃兄作者：杨萍，李杰，周凤华，李丽君，贾钰华【摘要】目的观察丹参酮A对过氧化氢诱导的心肌细胞损伤的保护作用及其机制。方法采用差数贴壁法体外分离培养新生乳鼠心肌细胞，以200mol/L过氧化氢作用2h模拟心肌细胞氧化应激模型，分别以丹参酮A高、中、低剂量在造模前干预24h。采用MTT法检测细胞活力，流式细胞仪AnnexinV-PI双染法检测细胞凋亡率，检测心肌细胞总抗氧化能力（T-AOC）、LDH活性、MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力、CAT活力。结果模型组心肌细胞经200mol/L过氧化氢作用2h后，细胞活力显著降低，凋亡率显著增高。与模型组比较，丹参酮A显著增加心肌细胞活力，降低细胞凋亡率。过氧化氢可导致心肌细胞LDH活性及MDA含量显著增加，并使总抗氧化能力（T-AOC）、SOD活力、GSH-Px活力、CAT活力显著降低，丹参酮A可呈浓度依赖性显著降低LDH活性及MDA含量，增加总抗氧化能力（T-AOC）、SOD活力、GSH-Px活力、CAT活力。结论丹参酮A可以抑制过氧化氢诱导的心肌细胞损伤，这可能与其增强细胞抗氧化酶活力，降低脂质过氧化反应有关。【关键词】丹参酮A；心肌细胞；氧化应激ChinaAbstract：ObjectiveTostudytheprotectiveeffectandmechanismofTanshinoneAonmyocardialdamageinducedbyhydrogenperoxide.MethodsPrimaryculturedneonateratmyocardialcellwasculturedinmediumwith200mol/Lhydrogenperoxide,andthemediumwassupplementedwithdifferentconcentrationsofTanshinoneAinadvance.CellviabilitywasdeterminedbyMTTmethod.AnnexinV/PIbivariatedyEingwasusedtodetectapoptosisrate.Besides,T-AOC,LDH,MDA,SOD,GSH-Px,CATweredetectedtoevaluatecellantioxidantability.ResultsInmodelgroup,cellviabilitydecreasedsignificantlyandapoptosisraterosesignificantlycomparedwithnormalgroup.Comparedwithmodelgroup,TanshinoneAincreasedcellviabilityanddecreasedapoptosisrateinadose-dependentmanner.Comparedwithnormalgroup,LDHandMDAincreasedremarkably,andT-AOC,SOD,GSH-Px,CATweredroppedremarkablyinmodelgroup.Comparedwithmodelgroup,TanshinoneAdecreasedLDHandMDAsignificantly,andincreasedT-AOC,SOD,GSH-Px,CATsignificantlyinadose-dependentmanner.ConclusionTanshinoneAcanreducemyocardialdamageinducedbyhydrogenperoxide,themechanismmayberelatedwiththeenhancementantioxidaseactivity,anddecreaseoflipidperoxidation.Keywords：TanshinoneA;Myocardialcell;Oxidativestress随着冠状动脉内溶栓、冠脉球囊扩张及冠脉搭桥等内外科治疗缺血性心脏病手段的广泛应用，在恢复缺血心肌的再灌注挽救缺血心肌的同时，缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤所带来的问题日益明显1。许多实验研究已证明，在心肌损伤区有大量自由基产生，自由基产生的氧化损伤是心肌损伤的重要因素，而应用自由基清除剂可以减轻组织细胞的损伤2。丹参是我国的传统中药，被广泛用于冠心病的治疗。丹参酮A（tanshinone,TSN）是丹参最重要的生物活性部分3。本实验以体外培养的乳鼠心肌细胞为基础，以H2O2诱导细胞损伤为模型，旨在研究丹参酮A在氧化应激条件下对心肌细胞的保护作用，探讨其可能的作用机制，阐释丹参治疗心肌缺血性疾病的机理。1材料1.1动物出生13d雄性Wistar大鼠，SPF级，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号SCXK粤-20060015。1.2药品与试剂胎牛血清购自杭州四季青生物工程研究所；胰蛋白酶、DMEM培养基购于Gibico公司；丹参酮A购于中国药品生物制品检定所（批号110766-200417）；乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。2方法2.1分组原代乳鼠心肌细胞经分离、纯化后进行实验分组，分为以下几组：正常组：培养的正常心肌细胞培养；模型组：心肌细胞培养液中添加200mol/LH2O2作用2h；丹参酮A高剂量组：心肌细胞用丹参酮A110-4mol/L培养24h后添加200mol/LH2O2继续作用2h。丹参酮A中剂量组：心肌细胞用丹参酮A510-5mol/L培养24h后添加200mol/LH2O2继续作用2h。丹参酮A低剂量组：心肌细胞用丹参酮A110-5mol/L培养24h后添加200mol/LH2O2继续作用2h。2.2新生大鼠心肌细胞培养参照Goldenberg等4方法略加改进。取出生13dSD乳鼠，在75酒精中浸泡8s后取出，固定四肢。用无菌眼科剪剪开胸部，无菌眼科弯镊取出心脏。迅速将心脏放入装有冷D-Hanks液的培养皿中，去除心房及心外膜的结缔组织，将心室剪开，洗净残血，反复洗3次。将心室肌在无菌培养皿侧壁剪碎成12mm3的小组织块。将小组织块移入50ml塑料离心管中，加入0.1胰蛋白酶5ml，37消化6min。自然沉淀后去除第1次上清，再加入5ml胰蛋白酶于37消化6min后，轻轻吹打，自然沉淀后，取上清移入15ml离心管中，加含血清培养基终止消化，1000r/min离心10min，洗两次。剩余沉淀继续加胰蛋白酶消化，如此反复消化710次直至组织块完全消化。将离心所得沉淀用含15胎牛血清的培养基制成细胞悬液，在CO2培养箱中差速贴壁1h，去除非心肌细胞（主要是成纤维细胞和内皮细胞）。1h后轻轻吸出细胞悬液，调整细胞密度，将心肌细胞悬液均匀接种于6孔板内，置于二氧化碳培养箱中培养。前48h加入终浓度为0.1mmol/L的5-溴脱氧尿苷，每24h换液1次。2.3心肌细胞活力检测采用MTT比色法测定心肌细胞活力。心肌细胞悬液以1.5104/ml接种于96孔板。分组处理后，每孔加入20lMTT（5mg/ml），在培养箱中37孵育4h。吸去上清，每孔加入DMSO150l。微孔振荡器上振荡10min。酶标仪检测570nm波长的吸光度值。每孔OD值减去空白孔OD值为测试孔OD值。活细胞数与OD值成正比。每组每个时间点设6个复孔，取其平均值。2.4心肌细胞凋亡吸出培养液，D-Hanks洗细胞3次，5min/次。向培养瓶中加入23ml0.125胰蛋白酶（使用前应预热至37左右），镜下观察细胞，待其变圆，细胞间分离但尚未脱落时倒去胰酶，加入原培养液终止消化，吹打瓶壁，使细胞脱落。将细胞悬液转移至离心管，1000r/min离心5min，加PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1106/ml，取0.5ml上述细胞悬液，1000r/min4min离心，弃上清，加0.5mlBindingBuffer重悬细胞，加入1l荧光标记的AannexinV试剂，混匀后避光室温下孵育20min。加入5lPI混匀后避光4下孵育5min，孵育后加入500lBindingBuffer，立即上流式细胞仪分析，激发波长Ex=488nm;发射波长Em=530nm。2.5总抗氧化能力及氧化平衡体系酶测定采用比色法测定总抗氧化能力（T-AOC），采用2,4-二硝基苯肼显色法检测LDH活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，二硫代二硝基苯甲酸法测定GSH-Px含量，钼酸铵法测定CAT活力。具体操作步骤参照试剂盒说明书。2.6统计分析计量数据以均s表示，采用SPSS13.0统计软件进行分析。多组数据间比较采用单因素方差分析(OneWayANOVA)处理，组间两两比较采用LSD法。检验显著性水准0.05。3结果3.1丹参酮A对过氧化氢所致心肌细胞损伤的细胞活力与细胞凋亡的影响与正常组比较，模型组心肌细胞活力显著降低，细胞凋亡率则显著增加；在改善细胞活力方面，丹参酮A高剂量组细胞活力较模型组显著增高，而丹参酮A中剂量、低剂量与模型组比较无统计学差异。在改善细胞凋亡率方面，丹参酮A各剂量组细胞凋亡率均显著低于模型组，中剂量与低剂量差异无统计学意义。结果见表1。表1丹参酮A对过氧化氢所致心肌细胞损伤细胞活力及细胞凋亡率的影响（略）3.2丹参酮A对过氧化氢所致心肌细胞损伤抗氧化能力的影响与正常对照组比较，模型组心肌细胞总抗氧化能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性显著降低，而LDH活性、MDA含量则显著增加；丹参酮A可呈剂量依赖性增加总抗氧化能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性，降低LDH活性、MDA含量。结果见表2。表2丹参酮A对过氧化氢所致心肌细胞损伤抗氧化能力4讨论在I/R时可产生大量的活性氧自由基，是I/R介导细胞结构损伤和功能代谢障碍的重要途径之一5。许多实验研究已证明心肌缺血再灌注损伤不仅引起细胞坏死，而且也诱导细胞凋亡6。心肌细胞的过度凋亡会导致心肌细胞数量的减少以及心肌结构破坏和功能障碍。本研究结果显示，外源性H2O2200mol/L可以导致心肌细胞活力显著降低，凋亡发生率显著增高。氧自由基损害细胞主要表现在可使许多生物大分子如核酸、蛋白、脂肪酸引起过氧化反应，使生物大分子出现交联或者断裂，从而引起细胞结构和功能的破坏。MDA是不饱和脂肪酸氧化的终产物，其水平的高低可反映机体脂质过氧化的程度。因此，测定MDA水平可间接反映出细胞受氧化损伤程度，是反映氧化应激较好的指标7。自由基激发的脂质过氧化物可以导致质膜损伤，LDH漏出率能较准确地证明包膜的完整性8。在本研究中，体外培养的心肌细胞在H2O2诱导的损伤时，MDA含量显著增高，表明心肌细胞在H2O2作用下产生了大量的脂质过氧化物。同时，细胞膜通透性发生改变，膜内LDH可透过细胞膜释放到培养液中，使培养液中LDH水平显著升高。机体的氧化应激是由于氧自由基过量生成与自由基清除系统的平衡状态被破坏，导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集，从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态。超氧阴离子自由基(O2-)、羟基自由基(OH)、过氧化氢(H2O2)和单线态氧(1O2)等是体内主要的活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）。体内ROS的增多可导致膜脂质发生过氧化、膜脆性增加、流动性降低9。SOD、GSH-Px、CAT是体内有效的自由基清除剂，它们的催化活性对维持氧化平衡系统是非常重要的10，11。SOD是一类金属酶，能催化-1价O2歧化(还原)成H2O2，在防御氧毒性中起着重要作用，SOD活力下降可能是因为消除过多产生的O-2所致。CAT可催化H2O2分解，GSH-Px可清除H2O2，阻断脂质过氧化的链锁反应，保护细胞膜结构和功能完整。CAT和GSH-Px降低可能是清除过多的H2O2引起的。另外，SOD在消除O-2时产生的H2O2进一步再被CAT和GSH-Px消除12，这也可能是CAT和GSH-Px降低的原因之一。T-AOC是在整体水平上反映机体或细胞抗氧化水平高低的重要指标。在本研究中，模型组T-AOC、SOD活性、CAT活性、GSH-Px含量显著降低，表明外源性H2O2可导致心肌细胞抗氧化防御机制受损。丹参酮A是我国的传统中药丹参重要的心血管活性成分，且具有抗缺血、改善微循环作用13。在本实验模拟的心肌细胞氧化应激模型中，丹参酮A可增加心肌细胞活力，降低细胞凋亡率。本实验通过检测心肌细胞经丹参酮A干预后的MDA含量、LDH活性、T-AOC，SOD活性、CAT活性、GSH-Px含量的水平，发现丹参酮A可呈浓度依赖性增加心肌细胞T-AOC、SOD活性、CAT活性、GSH-Px含量，而MDA含量、LDH活性则呈浓度依赖性显著降低。本实验结果表明，丹参酮A可提高心肌细胞对氧自由基的清除能力，降低脂质过氧化反应，从而减轻氧自由基介导的细胞膜结构与功能的损伤，以实现其对心肌细胞的氧化应激状态的保护作用。因此，在再灌注或恢复供氧早期给予丹参对于减轻心肌细胞损伤有着重要的意义。【参考文献】1SchferU,KurzT,JainD,etal.Impairedcoronaryflowandleftventriculardysfunctionaftermechanicalrecanalizationinacutemyocardialinfarction:roleofneurohumoralactivationJ.BasicResCardiol,2002,97(5):399.2SunY.Oxidativestressandcardiacrepair/remodelingfollowinginfarctionJ.Am.JMedSci.,2007,334:197.3王举涛,彭代银,刘金旗,等.不同产地丹参中丹参酮A的含量比较J.中国实验方剂学杂志,2008,14(3):4.4GoldenbergI,ShainbergA,JacobsonKA,etal.AdenosineprotectsagainstangiotensinII-inducedapoptosisinratcardiocyteculturesJ.MolCellBiochem,2003,252(1):133.5BognarZ,KalaiT,PalfiA,etal.AnovelSOD-mimeticpermeabilitytransitioninhibitoragentprotectsischemicheartbyinhibitingbothapoptoticandnecroticcelldeathJ.FreeRadicBiolMed,2006,41(5):835.6SodhaNR,ClementsRT,FengJ,etal.Theeffectsoftherapeuticsulfideonmyocardialapoptosisinresponsetoischemia-reperfusioninjuryJ.EurJCardiothoracSurg,2008,33(5):906.7SehirliO,TozanA,OmurtagGZ,etal.Protectiveeffectofresveratrolagainstnaphthalene-inducedoxidativestressinmiceJ.EcotoxicolEnvironSaf,2008,71(1):301.8金惠铭.病理生理学M.上海:复旦大学出版社,2005:173.9BenardG,BellanceN,JamesD,etal.MitochondrialbioenergeticsandstructuralnetworkorganizationJ.JCellSci,2007,120(5):838.10吕风亚,李义召,徐龙宪,等.硒对沙土鼠脑缺血再灌注损伤后MDA、GSH-Px及细胞凋亡的影响J.卒中与神经疾病,2003,10(4):198.11FreemanBA,CrapoJD.BiologyofdiscasefreeradicalsandtissueinjuryJ.LayInvest,1982,47(5):412.12BhattacharyaA,GhosalS,BhattacharyaSK.Anti-oxidanteffectofWithaniasomniferaglycowithanolidesinchronicfootshockstress-inducedperturbationsofoxidativefreeradicalscavengingenzymesandlipidperoxidationinratfrontalcortexandstriatumJ.JEthnopharmacol,2001,74(1):1.13周四桂,王平,王朝禾,等.丹参酮A对自发性高血压大鼠左心室谷胱甘肽-S-转移酶2表达的影响J.中国临床药理学与治疗学,2008,13(1):57.皋浦园缸声段逼瘁喇虹板亨拱茨黔喷否暗鹤争兑捅