一种新型苯并呋喃并萘二酮衍生物（8e）在体内和体外对人类结肠癌细胞抗增殖活性及其相关分子机理探讨课件

,Antitumor effects of a novel benzonaphthofurandione derivative (8e) on the human colon cancer cells in vitro and in vivo through cell cycle arrest accompanied with the modulation of EGFR and mTOR signaling,一种新型的苯并呋喃并萘二酮衍生物（8e）通过调节表皮生长因子受体(EGFR)和调节雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号发送从而诱导细胞周期停滞进而对体外和体内的人结肠癌细胞产生抗癌作用,细胞生物学20th 宋继达&郭羽,论文信息,1.文章所刊登的学术杂志：Chemico-Biological Interactions (化学与生物相互作用) 发表时间：2011年5月3日 2.文章作者： 韩国首尔国立大学药学院 Hwa-Jin Chung， Sang Kook Lee 韩国首尔梨花女子大学药学院 Hee-Kyung Rhee，Hea-Young Park Choo 3.关键词： 苯并呋喃并萘二酮衍生物 (Benzonaphthofurandione derivative) 癌细胞 HCL116 抗癌活性 (Antitumor activity) G0/G1期的细胞周期停滞 (G0/G1 cell cycle arrest) 表皮生长因子受体/雷帕霉素靶蛋白信号发送 (EGFR/mTOR signaling),ppt结构,1.Introduction,2.Methods and results,3.Discussions,主要实验流程,1.测定对比8e和阿霉素对癌细胞的增殖抑制效力（以半抑制浓度表示），并用倒置相差显微镜观察癌细胞前后形态,2.用不同浓度的8e处理癌细胞24h和48h，并用流式细胞术分析癌细胞的细胞周期分布,4.提取第2步得到的癌细胞中与细胞周期和信号转导相关的蛋白，并用Western blot技术分析这些蛋白质的表达水平，以推测8e的抑癌机理,3.将癌细胞移植到无胸腺小鼠身上使其长成肿瘤，分析8e和阿霉素对肿瘤生长的抑制效果，并对肿瘤组织进行免疫组化分析,1.Introduction,背景：结肠癌是世界范围内的头号癌症杀手之一，每年有大约一百万的新增病例。尽管全球结肠癌的发病率在逐步下降，但近年来由于饮食习惯的西化，亚洲国家结肠癌患者数目显着上升。因此仍有必要开发新型的抗结肠癌药物。 阿霉素(Doxorubicin) ，一种蒽环类化合物，是临床上用来作为治疗癌症的药物。 下面我们来看看8e和阿霉素(Doxorubicin)的化学结构式。,8e的结构式,阿霉素(Doxorubicin),【作用与用途】阿霉素是一种广谱抗肿瘤抗生素，可抑制RNA 和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，对多种肿瘤均有作用，属非周期特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。但有一定的毒副作用。 【毒性反应】白细胞和血小板减少，约60%80%的病人可发生；100%的病人有不同程度的毛发脱落，停药后可以恢复生长；心脏毒性，表现为心律失常， ST-T改变(ST和T 分别指两种心电波)、恶心、食欲减退；药物溢出血管外可引起组织溃疡及坏死。另外，用药后尿液可出现红色。,2.Methods and results,2.1化学试剂（Chemicals）（略） 2.2合成8e （Synthesis of compound 8e）：按已发表的文献提供的化学合成方法人工合成。 2.3癌细胞的培养（Cell culture）：人结肠癌细胞HCL116由美国模式培养物保藏所（ATCC）提供，用加富的RPMI1640培养基培养，该培养基另外加入了10%热灭活的胎牛血清（FBS），100单位/mL青霉素（盘尼西林），100ug/mL链霉素，250ng/mL两性霉素B。置于含5% CO2的控湿氛围中培养。,2.4 8e和阿霉素对癌细胞抑制效力的测定：,癌细胞HCL116(以1104 个/mL的密度植于96孔盘)分别加入不同浓度的8e或阿霉素(Doxorubicin)后置于37含5%CO2的控湿氛围中培养72h。经其他步骤处理后用570nm波长测量吸光度以求得存活细胞的数量，并用非线性回归分析的方法计算8e和阿霉素对癌细胞的半抑制浓度（IC50）。,8e和阿霉素对癌细胞的半抑制浓度,，,结果,计算结果表明阿霉素对癌细胞的半抑制浓度为46.2 nm /L，而8e对癌细胞的半抑制浓度为52.9nm/L，8e的抑癌效力稍逊于阿霉素。 用8e处理癌细胞24h和48h后用倒置相差显微镜观察癌细胞的形态。虽然癌细胞存活的数量随8e浓度增大而递减，但实验组的癌细胞与对照组相比并没有明显的形态学变化。,倒置相差显微镜对8e处理后癌细胞的观察结果,8e处理后癌细胞变得稀疏，但没有明显的形态学变化。,2.5 8e对癌细胞细胞周期分布的影响,用磷酸盐缓冲液配制25、50、75nm/L的8e溶液为实验组，并以磷酸缓冲液为空白对照，分别处理癌细胞，在24h和48h后用流式细胞仪分析癌细胞的细胞周期分布。,流式细胞术分析细胞周期分布的结果,结果表明细胞周期停滞在G0/G1时期与8e的浓度有关,2.6蛋白质印迹分析,将经过25、50、75nm/L的8e处理24和48小时后的癌细胞的总蛋白质提取出来后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离并电转移到聚偏二氟乙烯薄膜上，薄膜用特制的缓冲液在室温下处理1h，接着用以磷酸盐缓冲液稀释的特异性抗体进一步在4下过夜处理。然后用特制的缓冲液洗涤后，薄膜在室温下用二抗标记的辣根过氧化物酶继续处理2h，然后用荧光影像分析仪配合辣根过氧化物酶荧光检测试剂盒来显像。,蛋白质免疫印迹分析图谱,蛋白质免疫印迹分析图谱,2.7小鼠体内肿瘤生长抑制实验,实验采用6星期大的雄性无胸腺小鼠(athymic mice)。 在第0天将HCL116癌细胞悬液皮下注射到每只小鼠的右侧腹部，当肿瘤体积长到9095mm3时（约在接种后第7天）开始用8e或阿霉素对小鼠进行治疗。 实验之前小鼠被随机分为6组（5个实验组和1个对照组），每组6只。 5个实验组： 阿霉素3mg/kg/day, 8e 2mg/kg/day , 8e 5mg/kg/day , 8e 10mg/kg/day , 8e (5mg/kg/day)阿霉素(3mg/kg/day) 8e和阿霉素分别溶于磷酸盐缓冲液并设置1个只有溶剂的空白对照。5组药物都是以腹膜内注射的方式给药，每周3次，持续3周，每组共给药9次。,小鼠体重和肿瘤体积的变化,自接种癌细胞当天起，于第0、9、18、24、28天对小鼠进行体重称量和肿瘤体积的测量。（在第28天实验结束可以将小鼠身上的肿瘤摘取下来通过液体推排法测量肿瘤的体积，但由于实验过程中在不能摘取肿瘤的情况下也要测量肿瘤的体积，因此本实验中肿瘤体积的测量是通过较为精准地测量肿瘤的长宽高，然后用公式（体积=长 宽高 / 6）计算出来的。不同时期的小鼠体重以柱状图表示，肿瘤体积以折线图表示。,小鼠与摘取下来的肿瘤,小鼠体重的变化,肿瘤体积的变化,与对照相比的肿瘤抑制率,对肿瘤组织进行免疫组化分析,用抗Ki-67抗体对肿瘤组织进行免疫组化分析以检测癌细胞的增殖情况。Ki-67是一种与细胞周期相关的增殖细胞核抗原（PCNA）。 Ki-67是目前多种恶性肿瘤尤其是乳腺癌研究中的热门生物标志物，可以通过对Ki-67的检测了解恶性肿瘤的细胞增殖活性。,肿瘤的免疫组化分析结果,分析结果表明8e抑制了增殖细胞核抗原Ki-67的表达。,小鼠治疗实验的结论,经过3周的药物治疗之后，10mg/kg/day的那个实验组与对照组相比，肿瘤的抑制达到58.7%。与对照组相比，实验组小鼠没有观察到明显的体重变化和副作用。同时，免疫组织学分析表明，在异种移植的癌细胞中，8e抑制了增殖生物标志物Ki-67的表达，表明8e的确有效地抑制了癌细胞在体内的增殖。,3.Discussion（重点）,在最初的研究中作者发现8e对多种人类癌细胞系都有生长抑制作用，而在固态肿瘤（实体肿瘤）中人结肠癌细胞HCL116的生长对8e的抑制活性尤为敏感。因此他们设计实验，从细胞周期调控蛋白的表达和细胞信号传导途径两个方面进一步研究8e对人结肠癌细胞的作用机理。,cyclin与CDK的功能： 一般认为细胞周期蛋白（cyclins）和周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是细胞周期的的调控者并通过相互结合形成cyclin-CDK复合物来起作用。在细胞周期的不同时期，不同的cyclin-CDK复合物通过使特异的转录因子或其他蛋白质的磷酸化，开启或关闭某些基因的表达，或直接调节某些蛋白质的活性，从而推动细胞周期的更替。但是癌细胞的细胞周期调控蛋白失控并导致细胞的异常增殖。,Part 1,细胞周期的一般模式,G1/S检控点,CDK4 、CDK6与cyclinD形成的复合物主要在G1期起作用，促进G1/S转变,CDK2 与cyclinE形成的复合物作用于S期的起始阶段,CDK2与 cyclinA形成的复合物的作用贯穿于整个S期,CDK1与cyclinA或cyclinB（主要是cyclinB )形成的复合物则在G2/M转变中发挥作用,G1/S转变的调控机理,在细胞周期G1/S转变过程中，首先由cyclinD（D1、D2、D3）与CDK4和CDK6结合形成cyclinD-CDK复合物，然后进入细胞核内， CDK的某些位点被CAK（周期蛋白依赖性激酶活性激酶）磷酸化。磷化后具有激酶活性的cyclinD-CDK复合物使pRb-E2F复合物（E2F是一种转录活化因子）中的pRb（视网膜母细胞瘤蛋白，一种细胞周期抑制蛋白）磷酸化为p-pRb， 但pRb上有多个可磷酸化的位点，仅仅靠cyclinD-CDK对其进行磷酸化是不够的，随后还需要cyclinE-CDK2继续对pRb上的其他位点进行磷酸化，以及cyclinA/B依赖性激酶的活化来维持p-pRb的高度磷酸化状态。 p-pRb不具有与E2F结合的活性，因而释放转录因子E2F。被释放的E2F进入核内结合一系列的基因启动区（c-myc、b-myb、cdc2等）促进这些基因的转录，使细胞通过G1/S检控点，从G1期进入到S期。,简意图,促分裂信号,CyclinD水平升高,CDK2,CDK4,cyclinD-CDK2,cyclinD-CDK4,pRb-E2F,p-pRb,pRb 磷酸化,E2F,活化相关基因的转录,细胞通过G1/S检控点，从G1期转变到S期,cyclinE-CDK2,继续磷酸化,cyclinA/B-CDK,维持高度磷酸化 不再结合E2F,进入 核内,增殖细胞核抗原 PCNA,PCNA是一种由三个相同亚基组成的，总相对分子质量为29kD的环状同源三聚体蛋白，在细胞核内合成并分布于细胞核内，是真核生物DNA聚合酶的辅助蛋白。 PCNA的三聚体环形结构环绕着双链DNA，起到滑动发夹的作用，相当于原核生物DNA聚合酶的亚基，极大地增强了真核生物DNA聚合酶的持续合成能力，而且PCNA也参与DNA的损伤修复。,P21的抑制作用,P21：一种细胞周期抑制蛋白 p21可以与cyclin-CDK复合物结合从而抑制CDK的激酶活性，进而使pRb不能维持磷酸化状态，而且cyclin-CDK的其他一些生物学活性也不能实现。最终将无法转录一系列与细胞周期时相转变（如从G1期转变为S期）相关的基因，从而导致细胞周期停滞。 P21与PCNA结合可以抑制PCNA与双链DNA的连接，从而抑制DNA的复制过程。,8e对细胞周期调控蛋白表达水平的影响,如蛋白质印迹图谱所示， （1）表达水平上调的因子有：细胞周期抑制蛋白p21； （2）表达水平下调的因子有： cyclin D1、 cyclin A、 cyclin E 、CDK2 、CDK4、 c-Myc 蛋白（原癌基因c-Myc的表达产物）、 pRb（视网膜母细胞瘤蛋白，是一种细胞周期抑制蛋白） 、 p-pRb（磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白）、 PCNA（增殖细胞核抗原） 结论：8e介导的G0/G1期的细胞周期停滞与周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p21的上调和CDK2 、CDK4、 cyclin D1、cyclin A and cyclin E 的下调有关。,Part 2 名词解释1,1.表皮生长因子受体（EGFR）：一种可被胞外促有丝分裂因子（包括表皮生长因子、转化生长因子 、双调蛋白和乙胞素）所激活的典型的酪氨酸蛋白激酶受体（RTK，245页）。很多癌细胞，包括结肠癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈部鳞癌等癌细胞都有EGFR过分表达的现象。,2.雷帕霉素靶蛋白（mTOR）：广泛存在与各种细胞中，在细胞增殖、迁移、分化和生存中发挥重要作用，而且也是Akt（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）促进细胞生存和抑制细胞凋亡的下游靶标。同时mTOR也通过激活激酶P70S6K和抑制翻译起始因子eIF4E的抑制物4E-BP1来参与许多生存蛋白的起始翻译。,名词解释2,PIK3：磷脂酰肌醇3激酶（254页），也就是磷脂酶C（PLC，237页），可以将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2，238页）水解为二脂酰甘油（DAG）和1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）。 Akt：又称PKB（蛋白激酶B），是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞存活和凋亡中起重要作用。 PI3K-Akt信号途径是一条经典的信号途径。 ERK：细胞外信号调节激酶，是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的三大亚族之一，是哺乳类动物中了解的最为清楚的MAPK亚族，其信号传递通路为典型的MAPKKK/MAPKK/MAPK三级酶促级联反应，是调节细胞生长、发育以及分化的信号网络的核心。,名词解释3,c-Src ：是一种非受体酪氨酸蛋白激酶（即胞质酪氨酸蛋白激酶），其活化机制与受体酪氨酸蛋白激酶（RTKs）相似，同样需要自身磷酸化和受体二聚化。 mTOR： 雷帕霉素靶蛋白， 通过与多种蛋 白结合成2种复合物 mTORC1和mTORC2 发挥其生理功能。 STAT ：信号传导及转录激活因子，可被特定的酪氨酸激酶（如c-Src ）磷酸化为p-STAT，p-STAT发生聚合形成同源或异源二聚体活化态，进入核内与靶基因启动子序列的特定位点结合,促进其转录。已成功克隆4种JAK(JAK13和Tyk2)与7种STAT(STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5a，STAT5b，STAT6)。,EGFR激活后有3条胞质信号通路： MAPK通路 PIK3通路 c-Src通路 真核细胞内已发现的激活mTOR的信号通路： PI3K / AKT / mTOR Ras /MAPK /mTOR AMPK /mTOR （ AMPK 是腺苷酸活化蛋白激酶） 氧气 / mTOR 氨基酸 / mTOR,构成EGFR/mTOR信号通路,1,2,3,TSC1 /2和Rheb是连接Akt和复合物mTOR1 的两个因子,PI3K / AKT / mTOR信号通路,mTOR通过与多种蛋白结合形成两种复合物mTORC1和mTORC2发挥生理功能,mTOR很重要的一条下游通路就是调控蛋白质的合成： 在mTORC1的靶蛋白中， 4E-BP1（真核翻译起始因子4E结合蛋白 ）和p70S6K （ 核糖体蛋白S6激酶，254页）在控制蛋白质的合成方面起到重要作用。 而mTORC1磷酸化4E-BP1和p70S6K 。 4E-BP1发生磷酸化后使elF4E（真核翻译起始因子4E ）释放并活化，活化的elF4E启动mRNA 翻译，翻译产物含有与细胞周期相关的蛋白，细胞周期蛋白就在其中。 p70S6K是真核生物核糖体 40S 小亚基S6蛋白（254页）的激酶，活化的p70S6K使细胞内40S核糖体蛋白S6磷酸化，p- p70S6K 可促进mRNA的翻译。翻译产物主要是核糖体蛋白、翻译起始因子和翻译延伸因子等翻译装置的必需组分。,mTOR在细胞生长、增殖过程中起重要作用，但是持续激活的PI3K/AKT/mTOR 信号与肿瘤的发生发展关系密切，它能加速细胞周期、减少细胞凋亡、并促进肿瘤细胞的迁移。胶质母细胞瘤中，RTKs /mTOR 通路（包括PI3K / AKT / mTOR和Ras /MAPK /mTOR这两条下游通路）发生异常的比例达88% 。同时该通路的激活不但与肿瘤的形成相关，而且与肿瘤的恶性程度相关。所以该通路成为靶向治疗肿瘤的研究热点。mTOR作为该通路下游重要的调节分子，是调节细胞周期进程和细胞生长的信号聚会点，无疑也成为肿瘤研究的热点。,8e对EGFR/mTOR信号转导通路的影响,因此，8e通过抑制EGFR/mTOR信号通路中多种信号传递因子的表达和活化，从而抑制癌细胞的增殖。,文章结论,总而言之，本研究探讨了一种新型的苯并呋喃并萘二酮衍生物8e对体外和体内的人结肠癌细胞的抗增殖效力及其分子机理。这是目前第一次报道化合物8e通过诱导G0/G1期的细胞周期停滞和抑制EGFR / mTOR信号通路从而有效抑制人结肠癌细胞的生长。而且，以小鼠为对象得到初步实验中没有观察到8e有明显的副作用。 综上所述，化合物8e可能成为一种治疗人类结肠癌的新型药物。,谢谢！,本文观看结束！,谢 谢 欣 赏！,5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响,5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响 作者：杜雅冰，邵应举，樊青霞，孙桢，王琳，赵培荣 作者单位：(郑州大学第一附属医院肿瘤内科，河南郑州 450002) 【摘要】目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)基因表达的影响。方法选取食管鳞癌细胞株Eca9706，并用不同浓度的5-Aza-CdR处理该细胞株。MTT法检测干预前后细胞增长率的变化，FCM法检测干预前后细胞凋亡率的变化，RT-PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2基因mRNA的表达，免疫组化检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2蛋白的表达。结果 食管鳞癌细胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化状态，经5-Aza-CdR处理后，超甲基化状态解除，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率明显提高(P0.05);细胞中TFPI-2蛋白表达明显增强，同时mRNA的表达水平也较处理前明显提高(P0.05)。结论 食管癌细胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mRNA表达，当其超甲基化解除后，细胞增殖受到抑制，同时细胞凋亡率相应提高。,【关键词】 食管癌;组织因子途径抑制物-2;5-氮杂-2-脱氧胞苷;甲基化;免疫组化;逆转录聚合酶链反应;凋亡 ABSTRACT： Objective To explore the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine (5-Aza-CdR) intervention on the growth and proliferation of Eca9706 cell line and protein expression of tissue factor pathway inhibitor-2 (TFPI-2). Methods Eca9706 cell line was treated by 5-azaCdR of different concentrations; MTT， flow cytometry， immunohistochemistry and RT-PCR were used to determine the cell growth， apoptosis， and the expression of TFPI-2 gene and its protein. Results Eca9706 cell line had hypermethylation of TFPI-2. After demethylation by 5-Aza-CdR treatment， the proliferation of Eca9706 was inhibited， the apoptosis rate was also increased significantly in the concentration-dependent manner. RT-PCR detected that mRNA expression of TFPI-2 gene in Eca9706 cell line recovered significantly (P0.05). Conclusion 5-Aza-CdR can slow the growth of Eca9706 cell， increase the apoptosis rate， reactivate the TFPI-2 gene transcription and protein expression by demethylation. KEY WORDS： esophageal carcinoma; tissue factor pathway inhibitor-2; 5-Aza-CdR; methylation; immunohistochemistry; RT-PCR; apoptosis,组织因子途径移植物2(tissue factor pathway inhibitor， TFPI-2)是丝氨酸蛋白酶抑制物，在调控肿瘤细胞浸润转移方面起着重要作用。目前，关于TFPI-2在食管癌中的基因表达情况的分析研究尚少。本研究旨在探讨TFPI-2基因的失活机制，并寻找食管癌治疗的新靶点。 1 材料与方法 1.1 材料 RPMI-1640培养基购自北京索莱宝生物科技有限公司;标准胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限公司;Trizol试剂购自MBI公司;RT-PCR试剂盒购自MBI公司;5-Aza-CdR购自Sigma公司;人食管癌细胞株Eca9706由郑州大学肿瘤生物学研究室惠赠。 1.2 细胞培养和药物处理 人食管癌细胞Eca9706以含10 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，37 、50 mL/L CO2培养箱培养，每23 d消化传代1次。 1.3 MTT法检测干预前后细胞增长率的变化 取对数生长期细胞，调整密度至5104/mL接种于96孔板，按5-Aza-CdR浓度分为6组：0、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 mol/L，每组复设5个孔。待细胞贴壁后，分别于24、48、72 h后加入MTT液，4 h后弃去上清液，每孔加DMSO 150 L，在490 nm波长测定各孔吸光度值(absorbance，A)。细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate， CPIR)按公式计算：CPIR=(1-实验组A均值/对照组A均值)100%。,1.4 流式细胞仪(FCM)检测干预前后细胞凋亡率的变化 取对数生长期细胞，按5105/mL的密度接种于6孔板内，待细胞贴壁后加药，分组如下：对照组(0 mol/L),1.6 mol/L 5-Aza-CdR组，25.6 mol/L 5-Aza-CdR组，102.4 mol/L 5-Aza-CdR组。每组均于5-Aza-CdR作用48 h后消化收集细胞，700 mL/L冰乙醇固定，流式细胞仪进行细胞凋亡测定。 1.5 RT-PCR技术检测TFPI-2基因mRNA的表达 分组同FCM，每组细胞均5-Aza-CdR作用48 h。TFPI-2的上、下游引物分别为5-GTCGATTCTGCTGTTTTCC-3和5-ATGGAATTTTC TTTGGTGCG-3，合成产物为440 bp;-actin作为内参照，上下游引物分别为5-AGGCATTGTGATGGACTCCG-3和5-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3，合成产物为301 bp。按照试剂盒说明书，用Trizol试剂提取细胞总RNA，经紫外分光光度计分析后，按Sigma公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作。先逆转录制备单链cDNA，再以逆转录产物为模板，用上、下游产物进行PCR反应扩增目的基因。反应条件为：94 预变性3 min，然后94 变性30 s,51 退火30 s,72 延伸30 s，循环30次，最后72 延伸5 min,4 保温。扩增片段经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。,1.6 免疫组化方法检测TFPI-2蛋白的表达 取对数生长期细胞，按5104/mL的密度接种于经预处理的盖玻片上，待细胞贴壁后加药(分组同RT-PCR)。培养48 h后加入40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min,30 mL/L H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下10 min,100 mL/L动物血清封闭，室温下10 min，滴加1100的稀释的TFPI-2抗体4 过夜，二抗室温下1 h，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37 孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片。另取爬片滴加PBS 液代替一抗作为阴性对照。结果判定：TFPI-2蛋白阳性信号均呈棕黄色颗粒样物质，位于细胞质内。光镜下随机选取10个视野(每个视野观察细胞数不少于100个)，按阳性细胞所占百分比进行结果判定。阳性率=(阳性细胞数/1 000)100%。 1.7 统计学处理 应用SPSS16.0软件进行统计学处理。实验数据采用均数标准差(x-s)表示，采用单因素方差分析加LSD两两比较法进行分析。检验水准=0.05。 2 结 果 2.1 干预前后细胞增长率的变化 经MTT检测，结果显示，实验组细胞抑制率明显高于未加药组，且随着作用时间的延长和浓度的增加而增加(表1)。表1 不同浓度的5-aza-CdR对Eca9706细胞增殖的影响,2.2 干预前后细胞凋亡率的变化 流式细胞仪分析可见，经不同浓度5-Aza-CdR诱导48 h后，Eca9706细胞各处理组凋亡率分别为(13.760.47)%、(26.970.39)%、(41.030.19)%，与5-Aza-CdR诱导浓度成正比。与对照组(1.390.27)%比较差异有统计学意义(P0.05)，且各浓度组间比较差异亦有统计学意义(P0.05，图1)。以上实验重复5次。 2.3 干预前后Eca9706细胞mRNA的表达情况 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，Eca9706细胞中TFPI-2 mRNA表达在各用药组和未用药组之间有明显差异，TFPI-2 mRNA在未用药组细胞中未见表达。经1.6、25.6、102.4 mol/L 5-Aza-CdR处理后可见TFPI-2 mRNA表达，表明在一定范围内随5-Aza-CdR药物浓度的增加TFPI-2 mRNA表达逐渐增强(图2)。图1 各组流式细胞凋亡散点图A：对照组;B：1.6 mol/L 5-Aza-CdR组;C：25.6 mol/L 5-Aza-CdR组;D：102.4 mol/L 5-Aza-CdR组。图2 5-Aza-CdR处理前后Eca9706细胞TFPI-2 mRNA的表达 M：DNA marker;-actin：301 bp;TFPI-2：440 bp;1：对照组;2：102.4mol/L组;3：25.6 mol/L组;4：1.6 mol/L组;5：H2O对照组。,2.4 干预前后TFPI-2蛋白的表达情况 免疫组化结果显示，经5-Aza-CdR作用Eca9706细胞48 h，,TFPI-2蛋白的阳性表达率增加，对照组、1.6 mol/L组、25.6 mol/L组、102.4 mol/L组TFPI-2蛋白的阳性表达率分别为(2.101.42)%、(9.312.70)%、(14.723.50)%、(68.203.20)%，不同浓度组之间以及用药组与对照组之间的差异均有统计学意义(P0.05，图3)。 图3 各组TFPI-2蛋白的表达情况 3 讨 论 人TFPI-2(hTFPI-2)基因定位于7q22区域，全长由8164个碱基组成，其cDNA全长为1 222 kb。其mRNA的启动子具有典型的管家基因特征，没有典型的TATA盒或CAAT盒，在推定的转录起始位点区域GC含量超过80%1。TFPI-2可在体内多种组织广泛表达，在这些组织内一旦出现肿瘤，TFPI-2的表达水平也会随之显著下降2。有研究证实，在绒毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤、纤维肉瘤和胸部恶性肿瘤组织中，与肿瘤产生相关的TFPI-2表达水平减少可能与其启动子的甲基化密切相关1,3-5。启动子区cpG岛高甲基化在肿瘤形成机制中的确切作用尚不清楚，然而众多证据表明，肿瘤抑癌基因CpG岛异常的甲基化导致基因失活和转录抑制是肿瘤发生的重要机制之一6-8。,目前，有体外实验表明，DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR通过去甲基化作用可使多种含有CpG岛的高甲基化抑癌基因重新表达，从而恢复抑癌功能9。本实验RT-PCR结果显示，TFPI-2在Eca9706细胞中无表达，经过不同浓度的5-Aza-CdR处理Eca9706细胞后，TFPI-2亦重新出现表达，且在一定范围内随药物诱导浓度的增大表达逐渐增强。MIZUNO等10研究表明，肿瘤细胞中DNMT的表达较正常的高412倍，也证实DNMT上调参与肿瘤发生。这与我们的实验结果一致。根据MTT实验可知，经过5-Aza-CdR干预处理过的Eca9706细胞增殖明显受抑制，且随着药物浓度的增加，抑制作用越明显。从本实验结果分析，DNA启动子区去甲基化能较明显地抑制食管癌细胞增殖，并与其诱导剂量呈正相关，推测这种抑制作用与去甲基化后重新激活TFPI-2基因的转录和表达有着直接关系;此外可能与去甲基化后诱导细胞凋亡有关。进而通过流式细胞仪分析，结果显示，经不同浓度5-Aza-CdR干预的Eca9706的细胞中，用药组与对照组相比细胞凋亡率凋亡率有所增加，并且与5-Aza-CdR诱导剂量有依赖性关系。BENDER等11在同等条件下用5-Aza-CdR处理恶性肿瘤细胞系和正常纤维细胞系时，发现肿瘤细胞增殖均被抑制，而纤维细胞增殖不被抑制。因此，5-Aza-CdR对Eca9706细胞增殖的抑制及凋亡的增加不是药物的毒性影响，可能是因为使TFPI-2重新表达的结果。,目前，国外以TFPI-2为药物研究靶点，就TFPI-2在肿瘤治疗、肿瘤临床诊断、促进伤口愈合和动脉粥样硬化治疗等领域中的应用，也正在进行广泛深入的研究。本研究用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理人食管癌Eca9706细胞株，检测TFPI-2基因表达的变化及其对细胞增殖和凋亡的影响，以期寻找治疗肿瘤的新靶点。 【参考文献】 1HUBE F， REBERDIAU P， IOCHMANN S， et al. Characterization and functional analysis of TFPI-2 gene promoter in a human choriocarcinoma cell line J. Thromb Res， 203， 109(4)：207-215. 2MIYAGIi Y， KOSHIKAWA N， YASUMITSU H， et al. cDNA cloning and mRNA expression of a serine protein 5 and tissue factor pathway inhibitor-2 J. J Biochem， 1994， 116(5)：939-942. 3RAO CN， SEGAWA T， NAVARI JR， et al. Methylation of TFPI-2 gene is not the sole cause