响应面法优化酶法提取紫薯花色苷的工艺研究--毕业论文.doc

青岛农业大学毕业论文（设计）题 目：响应面法优化酶法提取紫薯花色苷的工艺研究 姓 名： 王红 学 院： 食品科学与工程 专 业： 粮食工程 班 级： 2011级01班 学 号： 20113123 指导教师： 王宝维教授 2014年 5 月 29 日毕业论文（设计）诚信声明本人声明：所呈交的毕业论文（设计）是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，论文中引用他人的文献、数据、图表、资料均已作明确标注，论文中的结论和成果为本人独立完成，真实可靠，不包含他人成果及已获得青岛农业大学或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。论文（设计）作者签名： 日期： 年 月 日 毕业论文（设计）版权使用授权书本毕业论文（设计）作者同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文（设计）的复印件和电子版，允许论文（设计）被查阅和借阅。本人授权青岛农业大学可以将本毕业论文（设计）全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本毕业论文（设计）。本人离校后发表或使用该毕业论文（设计）或与该论文（设计）直接相关的学术论文或成果时，单位署名为青岛农业大学。论文（设计）作者签名： 日期： 年 月 日指 导 教 师 签 名： 日期： 年 月 日目录摘要1Abstract21 前言31.1 紫薯花色苷简介31.2 纤维素酶简介31.3 游离态及磁性固定化果胶酶简介31.4 紫薯花色苷提取工艺的研究进展41.5 课题意义和研究内容52 材料与方法62.1 实验材料62.2 实验仪器62.3 实验方法62.3.1 花色苷含量测定和得率的计算方法62.3.2 紫薯花色苷酶法提取工艺72.3.3 紫薯花色苷提取的单因素实验72.3.3.1游离态/固定化果胶酶添加量的影响72.3.3.2 酶解时间的影响72.3.3.3 料液比的影响82.3.3.4 酶解时间的影响82.3.3.5 酶解pH的影响83结果和讨论93.1 苋菜红标准曲线的测定结果93.2 单因素实验结果分析93.2.1 果胶酶添加量对花色苷得率影响的测定结果93.2.2 酶解时间对花色苷得率影响的测定结果103.2.3 料液比对花色苷得率影响的测定结果113.2.4 酶解时间对花色苷得率影响的测定结果123.2.5 酶解pH对花色苷得率影响的测定结果133.3 响应面法优化紫薯花色苷提取工艺的结果143.3.1 因素水平编码153.3.2 响应面实验设计与的结果153.3.3 回归模拟方程建立164 主要结论18致谢20参考文献21青岛农业大学 响应面法优化酶法提取紫薯花色苷的工艺研究22响应面法优化酶法提取紫薯花色苷的工艺研究粮食工程专业 王红指导教师 王宝维摘要：本文以紫薯为研究对象，开展了利用纤维酶和果胶酶酶解提取紫甘薯花色苷的研究，旨在了解酶解法提取紫薯花色苷的最佳工艺条件，包括酶解液pH值、游离态/固定化果胶酶添加量、酶解温度、酶解时间和料液比。结果表明固定化果胶酶明显优于游离态果胶酶的提取效果。在单因素试验基础上，采用响应面法分析，得出紫甘薯花色苷酶法提取的最佳工艺条件为：酶解温度 50、pH5.5、料液比（g：ml）1:15、固定化果胶酶添加量0.20%，在最佳工艺条件下的得率为 3.396mg/g。关键词：紫薯花色苷；固定化酶；果胶酶；得率Response surface methodology purple potato anthocyanin extraction processesFood Engineering Hong Wang Tutor Baowei WangAbstract：In this paper, purple sweet potato for the study, carried out the research use of cellulase and pectinase enzyme extracted from purple sweet potato anthocyanins, aimed at understanding the optimum conditions enzymatic extraction of purple sweet potato anthocyanins, including hydrolyzate pH value, free state / immobilized pectinase dosage, reaction temperature, reaction time and solid-liquid ratio. The results showed that the immobilized pectinase was significantly better than the extraction of the free state of pectinase. Based on the single factor tests, analyzed using response surface method, optimum conditions PSPA enzymatic extraction were: reaction temperature 50 , pH5.5, liquid ratio (g: ml) 1:15 immobilized pectinase amount 0.20% under the optimum conditions, the yield was 3.396mg / g.Key words:Purple sweet potato anthocyanins; immobilized enzyme; pectinase; yield1 前言1.1 紫薯花色苷简介 花色苷是分布于自然界的黄酮类天然水溶性色素，是重要的天然食用着色剂之一1，花色苷具备特殊的化学构造(缺电子特征), 能与活性氧核素反映。近年来研究表明:食用植物中的自然抗氧化剂如黄酮类化合物、多酚类化合物、花色苷等是抵抗活性氧核素反映引发的构造毁伤的主要成分。花色苷是具备较强抗氧化活性的天然化合物2。研究还表明:花色苷以完整糖苷的形式能被人体吸收, 且具有抗氧化、预防老年痴呆、预防高血压、抗炎症、抗突变、抗癌、抗肿瘤、抗糖尿病、保护血管、抗动脉粥样硬化等生理活性功能3。紫甘薯富含酰基化花色苷4，着色能力强、稳定性好色彩鲜艳、水溶性5。1.2 纤维素酶简介 纤维素酶，又被称为-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，是降解纤维素产生葡萄糖的一组酶的总称，主要包括 CX 酶、C l 酶、和-葡萄糖苷酶。C1酶作用于天然纤维素，把其转变成水合非结晶纤维素;CX 酶分为CX1 酶和 CX2 酶，CX1 酶是内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部剪切-1,4- 糖苷键，随即构成纤维糊精和纤维二糖，CX2 酶为外断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子非还原性末端作用；-葡萄糖苷酶又称纤维二糖酶，它作用于纤维二糖，生成葡萄糖，通过这些酶的协同作用将纤维素彻底降解为葡萄糖6。1.3 游离态及磁性固定化果胶酶简介果胶酶是分解果胶质的酶的通称，是多酶复合物，通常包括：果胶甲醋水解酶、原果胶酶、果胶酸酶三种酶，在这三种酶的联合作用下使果胶质完全分解。原果胶酶将天然果胶质转化成水可溶性果胶；果胶甲醋水解酶将果胶催化去掉甲醋基团，生成果胶酸；果胶酸中-1,4-糖苷键被果胶酸酶切断，生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸进入糖代谢途径被分解放出能量7。果胶酶的作用主要是破坏细胞壁结构，使得内容物最大限度的释放出来，从而有利于紫薯花色苷的提取，提高产率，研究表明，加入果胶酶也有利于其它酶的加入。 固定化酶(Immobilized Enzyme)是通过化学的或物理的方法，把酶分子束缚在载体上，其既保持了酶的天然活性，又便于与反应液分离，因此可以重复使用，是酶制剂中的一种新剂型。固定化酶载体材料的性能和结构对固定化酶的各种性能有着巨大的影响。固定化酶的载体材料有天然高分子材料、合成高分子材料、无机材料，以及现在的复合材料等8。固定化酶与游离酶相比，不仅稳定性有所提高，对温度和酸碱度的适应范围增大，对蛋白酶和酶抑制剂的敏感性降低，并且固定化酶可以回收、重复利用，能够降低生产成本，实现批量或连续操作的可能，适于产业化、 连续化、自动化生产9。1.4 紫薯花色苷提取工艺的研究进展 国内外对制备紫甘薯花色苷色素的研究还较少，应用较多的是溶剂提取法，进一步运用新技术提高提取效率，以及如何去除色素中的杂质来提高色素品质将成为今后研究的重点。目前大多采用提取方法包括水提法、酸化水提法和酸化乙醇提法10 ，从食品安全角度出发，通常采用柠檬酸、酒石酸的水溶液来提取花色苷11。由于柠檬酸是食品工业中常用的酸味添加剂，因此采用柠檬酸的水溶液作为提取溶剂将更有利12。近年来，生物酶法由于其专一性强、效率高13等优点，在植物有效成分提取中得到了广泛应用。但酶法提取紫甘薯花色苷的研究甚少，一般采用淀粉酶14、纤维素酶或果胶酶等单一酶提取方法。李金林15对酶解法进行了深入研究，研究结果表明酶解法相比于柠檬酸水溶液提取的色价低，提取率降低约一半；而且酶的成本较柠檬酸高。郭城等16采用-淀粉酶水解提取紫甘薯花色苷色素，研究了反应温度、时间、pH值以及酶与底物比对提取效果的影响，结果表明最佳提取条件为：反应温度60，pH值55，反应时间70 min，酶与底物比400 uml。 李辉等17研究了酶-超声波联用提取紫薯色素的工艺条件，确定最佳提取工艺条件为：纤维素酶用量20IU/g，酶解时间45min，酶解温度50，酶解pH5.6，料液比110（g/mL），超声时间20min，超声温度60。在最佳提取工艺条件下，最佳提取次数为三次时，紫薯色素的提取率可达98.7%。同时对比了酶法、超声法、酶-超声联用法三种提取方法，结果表明酶-超声波联用法的紫薯色素提取率较酶法、超声法分别提高了39.3%和20.3%。研究表明酶-超声波联用法能更好地提取紫薯色素，为紫薯色素的提取提供了一种新工艺。 王琴等18以紫甘薯全粉为原料,研究溶剂浸提法、微波萃取法和超声波萃取法对紫甘薯花色苷色素提取效果的影响。结果表明:溶剂浸提法产率较低,提取时间较长;超声波萃取法产率较高,但色素纯度较低;微波萃取法是一种较好的提取方法:以0.5%柠檬酸水溶液为提取剂,pH2.5,微波辐射功率900W,料液比1:70,提取时间2min,提取2次,产率达5.94%,色价为8.7。其产率是溶剂浸提法的1.24倍,超声波萃取法的1.04倍;其色价是溶剂浸提法的1.12倍,是超声波萃取法的1.16倍。1.5 课题意义和研究内容1.5.1课题意义 酶法提取花色苷具有催化效率高，条件温和等优点，因此受到了广泛的欢迎，但由于酶的价格高和不易回收的缺陷，限制了酶法提取紫薯花色苷工艺的实际推广应用，而固定化酶与游离酶相比，不仅稳定性有所提高，并且可以回收利用，节约生产成本。 本文首次采用磁性固定化果胶酶提取紫甘薯花色苷，并与游离态果胶酶形成对照组，探究了酶解法提取紫甘薯花色苷最佳工艺条件，包括pH值、酶用量、酶解温度、酶解时间和料液比，得到了比现有方法更高的提取率的理论方法及数据，为实现紫薯花色苷批量化生产提供了理论依据。1.5.2研究内容（1） 本文以紫甘薯为原料，利用纤维酶和果胶酶提取紫甘薯花色苷，探究酶解法提取紫甘薯花色苷最佳工艺条件，包括酶解液pH值、酶用量、酶解温度、酶解时间和料液比。（2） 同时比较游离态果胶酶与固定化果胶酶提取紫薯花色苷得率的差异。在单因素试验基础上，采用响应面法分析，确定紫甘薯花色苷双酶法提取的最佳工艺条件 。2 材料与方法2.1 实验材料新鲜紫薯（-4下保存） 青岛城阳大润发售果胶酶(30000u/ul) 购自蔚蓝生物集团有限公司（青岛）纤维素酶(400u/mg) 购自蔚蓝生物集团有限公司（青岛）磁性固定化果胶酶 购自蔚蓝生物集团有限公司（青岛）抗坏血酸 莱阳市康德化工有限公司苋菜红标准品 国药集团化学试剂有限公司柠檬酸 (分析纯) 天津惠瑞化工科技有限公司柠檬酸钠(分析纯) 天津市巴斯夫化工有限公司 蒸馏水 实验室自制2.2 实验仪器XS-204电子分析天平 梅特勒-托利多集团FW100型高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司UV-1100型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司101-2A电热鼓风干燥 龙口市先科仪器有限公司HH-420型电热恒温水浴锅 龙口市先科仪器有限公司SHZ-III型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂RE52-99旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂AR2104X奥豪斯Adventurer电子天平 上海启威电子有限公司DL-4000型离心机(4000r/min） 上海安亭有限公司玻璃仪器气流烘干器 郑州长城科工贸有限公司 海信冰箱 海信（北京）电器有限公司 其他为实验室常规玻璃仪器2.3 实验方法2.3.1 花色苷含量测定和得率计算方法紫甘薯中花色苷种类很多，不可能选取一种纯的花色苷作为标准对照品，因此参照王智勇19的方法，采用苋菜红作为对照品，绘制苋菜红标准曲线，方法如下： 精确称取苋菜红标准品精确称取 0.01g置于 100 mL 容量瓶中，用 pH 3.0 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容。然后分别取 0.00、0.40、0.80、1.00、1.20、1.40、1.80 ml 至 10 ml 容量瓶中，用同样的缓冲液定容。用 pH 3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液为空白对照，测定不同浓度的对照品溶液在 525nm 处的吸光度后，绘制标准曲线，得到回归方程。可以计算花色苷的含量(C)。 花色苷得率： W(mg/g)=式中：C 为花色苷含量，g/ml； V 为样液总体积，ml； M 为紫甘薯取样量，g2.3.2 紫薯花色苷酶法提取工艺新鲜薯洗净去皮、切片60烘干高速粉碎机粉碎称取定量紫薯粉配置成一定浓度溶液加酶，酶解在恒温水浴锅中浸提 离心 ( 4 000 r/ m in , 20 min )抽滤花色苷粗提取液旋转薄膜蒸发器蒸发浓缩干燥成品取新鲜紫甘薯洗去表皮上的泥土，除去霉烂、病虫污染部分，切成3mm左右薄片，60鼓风干燥箱烘干，干燥后高速粉碎仪粉碎，得到紫薯粉末；用0.1mol/L柠檬酸或0.1mol/L柠檬酸钠溶液将酶解液调至双酶法提取所需的酶pH、温度，按底物量加入适量的纤维素酶，放入事先调好酶解温度的水浴锅内酶解 1h 后，加入游离态/固定化果胶酶继续酶解一定时间后，酶解液 4000r/min 离心 30min 后，抽滤取上清液，于 90灭酶 10min，冷却后调至 pH3，得花色苷初提液，以pH3柠檬酸缓冲液为空白对照，测定紫薯花色苷在525nm处吸光度，每组测定三次取平均值。注：实验中为了减少花色苷的氧化损失，酶解液中加入适量的异抗坏血酸钠作为保护剂护色。2.3.3 紫甘薯花色苷提取的单因素试验本文选取不同的酶解时间、温度、pH、料液比、游离态/固定化果胶胶酶添加量作为酶法提取紫甘薯花色苷的单因素进行单因素实验。2.3.3.1 游离态/固定化果胶胶酶添加量的影响取 10g 干燥的紫薯粉，在料液比 1:15，酶解温度 45，游离态/固定化果胶酶添加量0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，纤维素酶1.5%，酶解 pH5，酶解时间1.5h的条件下，按 2.3.2所讲的酶法提取工艺提取。以蒸馏水做空白对照，在 525nm 处测定吸光度值，计算得到紫甘薯花色苷得率。2.3.3.2 酶解时间的影响取 10g 干燥的紫薯粉，在料液比 1:15，酶解温度 45，游离态/固定化果胶酶添加量0.15%，纤维素酶1.5%，酶解 pH5，酶解时间1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h的条件下，按 2.3.2所述的酶法提取工艺进行提取。以蒸馏水做空白对照，在 525nm 处测定吸光度值，计算得到紫甘薯花色苷得率。 2.3.3.3 料液比的影响 取 10g 干燥的紫薯粉，在料液比 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25，酶解温度 45、游离态/固定化果胶酶添加量0.15%、纤维素酶1.5%，酶解 pH5的条件下，按 2.3.2所讲的酶法提取工艺提取。以蒸馏水做空白对照，在 525nm 处测定吸光度值，计算得到紫甘薯花色苷得率。 2.3.3.4 酶解温度的确定 取 10g 干燥的紫薯粉，在料液比为 1:15，酶解温度为 40、45、50、55、60，游离态/固定化果胶酶添加量0.15%，纤维素酶1.5%，酶解 pH5的条件下，按 2.3.2所讲的酶法提取工艺提取。以蒸馏水做空白对照，在 525nm 处测定吸光度值，计算得到紫甘薯花色苷得率。2.3.3.5 酶解 pH 的确定 取 10g 干燥的紫薯粉，在料液比 1:15，游离态/固定化果胶酶添加量0.15%、纤维素酶1.5%，酶解 pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 的条件下，按 2.3.2所讲的酶法提取工艺提取。以蒸馏水做空白对照，在 525nm 处测定吸光度值，计算得到紫甘薯花色苷得率。3.结果和讨论3.1 苋菜红标准曲线的测定结果 按照 2.3.1的方法绘制苋菜红标准曲线。 以不同浓度所对应的吸光度值为横坐标，苋菜红溶液的浓度(g/mL)为纵坐标，绘制的苋菜红标准曲线如图 1 所示： 图 1 苋菜红标准曲线Fig. 1The standard curve of amaranth经由过程绘制出的尺度曲线，获得回归方程，即计算紫甘薯花色苷含量的公式。将酶法提取出的紫甘薯花色苷在 525nm 波长的吸光度 A，带入下列公式中计算紫甘薯花色苷的含量。 花色苷含量： C=25.649A+0.3411g/ml R=0.9985； 3.2 单因素实验结果分析3.2.1游离态/固定化果胶胶酶添加量的影响图2果胶酶不同用量所得浓度曲线Fig. 2Effects of the concentration of pectinase on the yield of purple sweetpotato anthocyanins 由图 2 可知，当酶添加量低于0.15%时，紫薯花色苷提取率随酶添加量的增加而明显提高；当酶添加量处于0.15%和0.20%之间，提取率随游离态/固定化果胶胶酶添加量增加明显下降；当酶添加量超过0.20%时，提取率随酶添加量增加缓慢下降。这可能是由于过量的果胶酶虽然破坏了色素与淀粉的牢固结合点，使色素能够摆脱淀粉的束缚游离出来；但同时过量的果胶酶也破坏了保护色素的糊精类物质，从而降低了色素的稳定性，因而紫甘薯花色苷的得率下降20。同时由图可知，固定化果胶酶比游离果胶酶得率明显提高，说明了在果胶酶用量相同的条件下固定化果胶酶活性要明显高于游离果胶酶。 3.2.2 料液比对紫甘薯花色苷得率的影响 图 3 料液比对紫甘薯花色苷得率的影响Fig. 3 Effects of Solid-liquid ratio on the yield of purple sweet potatoAnthocyanins由图 3 可知，当液料比处于1：51：10之间时，紫甘薯花色苷的得率随料液比的增加而明显升高，当液料比处于1：101：15之间时紫薯花色苷得率随料液比的增加而加大但曲线趋于平缓，得率变化不大,在料液比达到 1:15 时得率达到最高，而当料液比超过1:15之后随着料液比的继续增加，紫甘薯花色苷的得率呈缓慢下价趋势。这可能是由于料液比较小时，花色苷未完全溶解，得率较低，而随着料液比的增大，过量的色素逐渐溶解，得率随料液比增大而增加，当料液比达115时花色苷完全溶解，含量趋于稳定，而随后继续增加料液比，浸提液体积增大导致显示出吸光度降低，得率减少。考虑到节约利用材料，故选择 1:15 为最佳料液比。同时由图可知，固定化果胶酶比加入游离果胶酶得率明显提高，说明了在料液比相同的条件下固定化果胶酶活性要明显高于游离果胶酶。 3.2.3 酶解温度对紫甘薯花色苷得率的影响 图4 酶解温度对紫甘薯花色苷得率的影响Fig. 4Effects of enzymatic temperature on the yield of purple sweet potatoAnthocyanins由图4可以得出，酶解温度对果胶酶和固定化果胶酶提取提取紫薯花色苷得率的影响大不相同：游离态果胶酶的酶解温度低于45时，提取率随温度升高而明显提高，之后当温度超过45，提取率呈明显下降趋势；而固定化果胶酶当酶解温度低于45时，提取率随温度升高而明显提高，当温度处于45和50之间时，提取率缓慢提高，之后，温度超过50时提取率呈明显下降趋势。这可能是由于酶解温度超过了果胶酶的最适酶解温度时，使果胶酶活力显著下降所致，并且研究表明紫薯花色苷在高温条件下结构容易遭到破坏。故选择 45游离态果胶酶的最适酶解温度是，50为固定化果胶酶的最适酶解。固定化果胶酶和果胶酶相比，对温度的适应范围更宽一些。 同时由图可知，固定化果胶酶比游离果胶酶得率显著提高，说明了在温度相同的条件下固定化果胶酶活性要明显高于游离果胶酶。 3.2.4 酶解 pH 对紫甘薯花色苷得率的影响 图5 酶解 pH 对紫薯花色苷得率的影响Fig. 5 Effects of enzymatic pH on the yield of purple sweet potatoAnthocyanins由图 5 可知，在pH3.5-4.5范围内，紫甘薯花色苷得率随酶解 pH 的升高明显提高，当酶解 pH 4.5-5.0范围内是花色苷得率缓慢提高，当酶解pH达到 5.0 时，花色苷得率达到最高，而从 pH 5.0 开始，花色苷得率呈明显下降趋势。这可能是酸碱度过高，导致果胶酶活力下降，使细胞内花色苷溶解变缓或无法完全溶出，同时过高的酸碱度，会使花色苷本身构造发生变化，多重因素综合作用致使花色苷得率下降。故选择 pH 5.0 为最佳酶解 pH。同时由图可知，固定化果胶酶比游离果胶酶得率显著提高，说明了在酶解液pH相同的条件下固定化果胶酶活性要明显高于游离果胶酶。3.2.5酶解时间的影响图 6 提取时间对紫甘薯花色苷提取量的影响Figure 6 Effects of time on anthocyanins yield由图 6可知，在 酶解时间小于1.5h时，紫薯花色苷得率随酶解时间显著提高，而酶解时间在1.5- 2h时略有下降，随后当酶解时间超过2h时，花色苷得率又缓慢上升，当酶解时间达2.5h 时花色苷得率达到最大值，当酶解时间超过2.5小时后花色苷得率又呈下降趋势。这可能是由于酶解时间较短时，色素溶解没有完全溶解，随时间的增加色素逐渐完全溶解，但当时间过长后，花色苷处于长时间的酸性条件下，结构发生变化，可能生产无色的查尔酮结构21。又 1.5h 和 2.5h 的花色苷得率相差不大，从节约成本和提高效率的角度考虑，选择1.5h 作为最佳提取时间。 同时由图可知，固定化果胶酶比游离果胶酶得率显著提高，说明了在酶解时间相同的条件下固定化果胶酶活性要明显高于游离果胶酶。3.3 响应面优化紫甘薯花色苷提取工艺的结果 在单因素实验结果的基础，综合考虑各种因素对紫薯花色苷得率影响的显著性，确定四个主要因素，根据Box-bennken中心组合试验设计原理22采用4因素3水平的响应面分析方法，试验因素水平编码见表23.3.1因素水平表编码表1 因素水平编码Table1 Factor level coding编码CodeX1 酶解时间hydrolysis time(h)X2 酶解温度Reaction temperature()X3pHpHX4果胶酶添加量Pectinasecontent（%） 11454.50.1001.5 505.00.1512555.50.20利用Design-Expert Software8.06软件设计响应面试验方案，以X1、X2、X3、X4为自变量，以花色苷得率为响应值Y，测定结果见3。3.3.2响应面实验设计与结果表2响应面试验设计与结果Table2 Responsesurfacedesignandresults试验组别Trial no.X1酶解时间Reaction time（h）X2 酶解温度Reaction temperature（）X3 pHX4 酶添加量Pectinasecontent （%)Y 花色苷得率（mg/g)111003.28220-1-101.899301-103.0944001-13.329500-1-12.653600113.39670110 2.9728-1-1003.188910102.73210-1001 3.12511-10-102.822120-10-12.7951301013.137141-1002.036150-1013.0151610-102.701170-1102.86218010-13.13719-100-13.11320-10103.34121-11002.8462210012.39823100-12.0722400-112.51625*00003.12526*00003.20127*00003.11828*00003.26829*00003.2493.3.3 回归模拟方程建立利用Design-Expert Software8.06软件对表3中试验数据进行二次多项式回归模拟，建立如下回归公式。方程的回归分析与方差分析见表4。 回归公式：Y=3.250.27X10.22X20.25X30.048X40.4X1X20.12X1X30.097X1X40.27X2X30.034X2X40.051X3X40.27X120.20X220.19X321.50X42在上式中：Y为响应值紫薯花色苷得率，X1、X2、X3和X4分别为酶解时间、酶解温度、酶解液pH和酶添加量的编码值。酶解时间、酶解温度、酶解pH和酶添加量四个因素在设计时都经过无量纲线性编码处理，消除了因素量纲的影响23。回归方程中各项系数的绝对值的大小反映各项因素对响应值的影响程度，而系数的正负则反映这种影响的方向性24。由上述回归方程可知，各因素对紫薯花色个提取率的影响大小如下排序：酶解时间酶解pH酶解温度酶添加量。表3回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for regression model变异源source平方和Sum of Squares自由度df均方MeanSquareF值FValueP值ProbF模型 model3.93140.285.220.0019X1(Reaction time)0.8610.8615.99 0.0001X2（Reaction temperature ）0.5610.56 10.390.0061X3(pH)0.7210.7213.450.0025X4(Pectinase content )0.027 10.0270.500.0489X1X20.63 1 0.6311.740.0041X1X30.06010.0601.110.5096X1X40.02510.0250.460.6347X2X30.2910.295.470.0321X2X44.69214.6920.0870.0469X3X40.01010.0100.190.0120X120.4710478.73 0.0001X220.2710.275.00 0.0001X320.2310.234.19 0.0001X420.1510.152.74 0.0001残差 Residual0.75140.054失拟项 Lack of Fit0.75100.0751214.85 0.0001纯误差 Pure Error2.18046.200总差 Total4.6928R-SquardAdj R-Squard0.95710.9234注：P0.01，差异极显著；P0.05，差异显著。通过表4得知，方程自变量和因变量之间的线性关系明显，该模型回归性极显著（P0.01），失拟项不显著，该模型R2=95.71%，R2Adj=92.34%，说明该模型与试验模拟性良好25。自变量与响应值之间的线性关系显著，能够理论推测。由F检验可知各因子的贡献率为：X1X3X2X4，即酶解时间酶解温度pH酶添加量。方程一次项X1、X2、X3影响极显著（P0.01），X4影响显著（P0.05），二次项X12、X22、X32、X42影响极显著（P0.01），其中酶解时间与酶解温度，酶解液pH与酶解温度，酶添加量与酶解温度，酶解液pH与酶添加量的交互作用显著（P0.05），对紫薯花色苷提取率的影响如图7、图8、图9、图10所示：图7酶解温度与酶解时间图8酶解液pH与酶解温度图9酶添加量与酶解温度图10酶添加量与酶解液pH4.结论（1）通过单因素试验得出，利用固定化果胶酶法提取紫甘薯花色苷明显优于游离态果胶酶，两种酶提取花色苷的最佳工艺条件：游离态果胶酶：酶添加量0.15%、酶解温度50、酶解时间1.5h、酶解液pH5、料液比（g：ml）1:15。固定化果胶酶：酶添加量0.15%、酶解温度50、酶解时间1.5h、酶解液pH5.5、料液比（g：ml）1:15（2）通过响应面法对紫甘薯花色苷酶法提取工艺优化，综合考虑实际操作的方便性及试验方差结果，确定酶法提取紫甘薯花色苷的最佳提取工艺条件为：纤维素酶1.5%、酶解温度 50、pH5.5、料液比（g：ml）1:15、固定化果胶酶添加量0.20%，在最佳工艺条件下的得率为 3.396mg/g。致 谢 首先，要感谢敬爱的王宝维老师。从实验的设计与进行到论文的撰写与修改，王老师都给了我严谨细致的指导和极大的自主思考空间。他严谨的治学精神，渊博的专业知识和独创的教学思路是使对实验设计有了进一步的认识，对论的完成起到了至关重要的作用。另外，还要感谢同实验室的同学，是他们的鼓励支持着我克服困难，完成实验，对于自己不熟悉的实验仪器，他们总是耐心的知道，教会我熟练使用，没有这些同学我不可能完成整个实验。 最后，谨向参加答辩的各位老师表示衷心的感谢！在此向所有人一并致谢！参考文献1 MATEUS N, FREITAS V. AnthocyaninsM. America: Springer New York, 2009: 283-3042盖丽丽. 不同物种来源花色苷对A亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞生物活性的影响D.山东农业大学,20123 Noda Y, Anzai K,Mori A et al. Hydroxyl and superoxide anion radical scavenging activities of natural source antioxidants using the computerized JES-FR30 ESR spectrometer systemJ. IUBMB Life, 1997, 42(1):35-44. 4 BOVELL-BENJAMIN A C. Sweet potato: a review of its past, present, and future role in human nutritionJ. Advances in Food and Nutrition Research, 2007, 52(6): 1-59.5 彭强, 高彦祥, 袁芳. 紫甘薯及其花色苷的研究与开发进展J. 食品科学, 2010, 31(23): 401-404.6连喜军,陈良笛,王吰,鲁晓翔. 酶法水解甘薯提取三种紫甘薯色素J. 粮食与油脂,2008,01:19