植物原生质体提取培养1

实验原理：植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。高Ca高pH法和电融合法：PEG作为一种高分子化合物，2050的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗使原生质体融合得以完成。PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱这样将引起电荷的紊乱和再分布从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。实验内容 1原生质体分离 2原生质体融合 3原生质体及融合体的培养材料用品：三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2m滤膜、滤器、培养瓶（注：以上用品要进行高压灭菌）、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、超静工作台温度252，光照度1000Lx,光照1416h/d 的条件下培养。培养时间约1周。实验步骤：1溶液及培养基的配制(1)酶液(2)PEG融合液(3)13CPW洗液1纤维素酶1果胶酶0.7mol/L甘露醇0.7mmol/LKH2PO410mmol/LCaCl22H2OpH6.87.040% PEG (MW 1500-6000)0.3 mol/L葡萄糖3.5mmol/L CaCl22H2O0.7mm0l/L KH2PO4272 mgL KH2PO4101.0 mgL KNO314800 mgL CaCl22H2O2460 mgL MgSO4016 mgL KI0025 mgL CuSO413 WV甘露醇pH 6.0(4)20蔗糖溶液(5)黄瓜种子萌发与生根培养基（固体）：1/2MS（注：MS无机成份减半，蔗糖0.2%,琼脂0.7%）(6)黄瓜原生质体形成愈伤组织培养基(固体和液体)：MS+0.05mg/L NAA+1mg/L BA(MS成份见 )(7)黄瓜原生质体愈伤组织分化培养基(固体)：MS+5mg/L NAA(8) 无菌蒸馏水(9) 0.1% HgCl2注：以上（1）-（4）溶液均要用孔径0.2m滤膜过滤以除去细菌。（5）-（8）培养基等要进行高压灭菌2黄瓜无菌苗的培养精选饱满的黄瓜种子，浸种2030min后，用0.1% HgCl2表面消毒810min，无菌水洗涤45次，剥皮，种子接入1/2MS培养基中。置于温度252，光照度1000Lx,光照1416h/d 的条件下培养。培养时间约1周。3原生质体的分离取黄瓜无菌苗子叶，切成薄片后，置于酶液中和摇床上（6070rpm），在2528黑暗条件下，酶解57h,用200目网过滤除去未完全消化的残渣。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。加入3 4ml l3CPW洗液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液。用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸也，轻轻铺于20蔗糖溶液上(5ml离心管装3m120蔗糖溶液)，在1000rpm条件下离心510分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20的蔗糖与13 CPW之间，破碎的细胞残渣沉入管底。用200l移液器轻轻将状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液)，放入另一干净的离心管中加4ml l3CPW洗液，1000rpm离心2-5分钟，弃上清用血球计数板调整原生质体密度为105一106/ml（请参考细胞计数）之间。4原生质体融合将1-2滴原生质体混合物（密度分别为105一106/ml）滴入小培养皿，静置810分钟。相对方向加入2滴40的PEG溶液，静置10分钟，依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml含13甘露醇的CPW洗液洗涤，注意在第二、三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡；最后用液体培养基洗l一2次即可进行培养：5观察两种原生质体加入PEG融合液后，只发生粘连，在洗涤过程中才发生膜融合核融合通常于融合体第一次有丝分裂过程中发生。6培养(培养基的配制方法)将原生质体或融合体悬液铺于愈伤组织诱导培养基