细胞工程—动物细胞培养细节复习题.doc

动物细胞原代培养-技术细节1、原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。2、传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。3、无菌操作基本技术: 3.1实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。3.2每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。3.3实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。3.4无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。3.5实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面中央无菌区域，勿在边缘非无菌区域操作。 3.6小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 3.7工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。3.8定期检测下列项目： CO2 钢瓶的CO2 压力CO2 培养箱的CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 4、培养基4.1 液体培养基贮存于4 冰箱，避免光照，实验进行前放在37 水槽中温热。 4.2 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间谷氨酰胺可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量谷氨酰胺。 4.3粉末培养基配制(注意)： 细胞培养基通常须添加10 % 血清、pH 为7.2 - 7.4。粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。纯水配制。以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌。标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4。须作生长试验与污染测试。 5、抗生素 5.1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素 5.1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。 5.1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，须添加抗生素，待token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。 5.2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个培养瓶时，则须添加抗生素(青霉素100 units/ml + 链霉素100 ug/ml)。 5.3. 若要检测支原体，则培养基内不可添加庆大霉素，因庆大霉素会抑制支原体生长。6、血清：-20或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装4045 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。7. 血清之沈淀物 7.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。7.2显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，一般而言，此小黑点应不会影响细胞的生长。8、细胞冷冻保存注意事项：8.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好且存活率高之状态，约为80 90 致密度。 8.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 8.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色以510 ml 小体积分装，4避光保存，勿作多次解冻。甘油亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 9、冷冻细胞活化：1.快速解冻（轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化），以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。在解冻培养后隔日更换培养基大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后， 须立即放入37 C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。2 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。7 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 8 培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。 9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？ 一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于20 C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。 10 悬浮性细胞应如何继代处理？ 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。 11 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？ 欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。 12 细胞之接种密度为何？ 依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。 13 细胞冷冻培养基之成份为何？ 动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。14 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？ 冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。15 冷冻保存细胞之方法？ 冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 C 3060 分钟 (-20 C30 分钟*) -80 C 1618 小时(或隔夜) 液氮槽vaporphase 长期储存。 冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 C 至80 C 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。适用于悬浮型细胞之保存。16 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？ 冷冻管内细胞数目一般为每瓶1x106 cells/ml， 融合瘤细胞则以每瓶5x106 cells/ml 为宜。 17 应如何避免细胞污染？ 细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 18 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？ 加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。 19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？ 不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。 20 支原体污染会对细胞培养有何影响？ 支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。 21 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？ 直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 22 CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？ 定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。 23 为何培养基保存于4 C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？ 培养基保存于4 C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。 24 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？ 不同厂牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。25 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？ 研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误， 造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。 26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？ 研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于80 C 太久。 27 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？ 冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧 28 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基（SFM）。 29 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 30 GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 31 什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基32 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。34二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。 33目录上说，Hanks 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hanks 平衡盐溶液(HBS)和Earles平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。35当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。 36 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 37 大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。 38 在溶解的一周内使用贮存在4冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。 1. 保存血清最好的方法?建议血清应保存在-5至-2O。然而，若存放于4时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。2. 如何解冻血清才不会使产品质量受损?建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于28冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。3. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。4. 为什么要热灭活血清?加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。5. 有必要做热灭活吗?实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。6. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?GIBICO的胎牛血清 没有预老化，储存在28时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在20储存胎牛血清，避免反复冻融。7. 如何避免血清中沉淀物的产生?解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20至4至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20至37)，实验显示非常容易产生沉淀物。解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于37太久。若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守56，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。8细胞冻存复苏原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：1)细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 2)如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。大结晶会造成细胞膜、细胞器损伤和破裂。3)复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。细胞的冻存 冷冻保护剂：冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。一般只有红细胞、大多微生物和极少数有核的哺乳动物细胞冻存时可不加冷冻保护剂；但对大多数有核哺乳动物细胞来说，冷冻时必须加冷冻保护剂。渗透性冷冻保护剂：甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、甲醇等小分子， 其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤。非渗透性冷冻保护剂：主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚 乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等大分子物质。其保护机制的假说很多，其中有一种是，减少冰晶的形成。冷冻保存温度 :液氮温度（-196）是目前最佳的冷冻保存温度。在-196 时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-196 下均可保存十年以上。 -70-80 保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在冰点到-40 范围内保存细胞的效果不佳。note:甘油和DMSO并不防止细胞内结冰，在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让其渗透到细胞内，细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在4时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所以，冻存时DMSO平衡多在4下进行，一般需要4060分钟。9. 细胞株运输：1 )贴身运输：短途运输，挑选的生长状态良好的细胞装满培养基，将瓶口用酒精棉球擦拭遍，将瓶盖拧紧，酒精消毒后用封口膜封闭，整个瓶子外表面喷上酒精，用塑料手套包裹后，竖力贴身放置（或者比较温暖的地方），运输途中尽量避免剧烈震荡（避免培养基与瓶口接触）细胞取回后，半量换液（保留吸出的大部分的培养基，以备以后半量换液用）2 )冰瓶运输：短途运输，从液氮中取出细胞，放入冰盒中转运至新的实验室。3 )液氮罐运输：短途及长途运输，从液氮中取出细胞，放入装满液氮的小型液氮罐中转运至新的实验室10.收到T25 培养瓶包装细胞， 处理方式为： 1. 寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 培养瓶均加满培养基。收到后应检查培养瓶外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打