[自然科学]免疫学试验技术.ppt

二、免疫血清学技术,凝集试验,沉淀试验,补体参与的 试验,标记抗体技术,中和试验,直接凝集试验 间接凝集试验 SPA协同凝集试验 桥梁凝集试验,絮状沉淀试验 琼脂扩散试验 免疫电泳 火箭免疫电泳,补体结合试验,免疫荧光抗体技术 免疫酶技术 同位素标记技术,中和试验,用 途,定性 定量 定位,种 类,+ + - + + - + + - + + -,+ + - + + - + - - + + -,+ + -,+ + + + + + + + +,+ + -,一、免疫血清学技术,种类： 1. 凝集试验 细菌和红细胞等颗粒性抗原，当与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下可逐渐凝集，出现肉眼可见的凝集现象称为凝集反应（直接凝集试验） 。,间接凝集试验 将可溶性抗原或抗体结合在一种与免疫无关的惰性微粒表面，然后与相应的抗体或抗原作用，在有电解质存在的适宜条件下，微粒即可被动的被凝集，出现肉眼可见的凝集现象。通过微载体进行的凝集试验叫间接凝集试验，也称微载体技术。 常用的微载体：致敏红细胞、聚苯乙烯乳胶、炭粉颗粒,Ag +,（红细胞、乳胶、炭）,载体,载体,Ag,Ag,Ag,Ag,Ag,Ag,Ag,Ag,间接凝集反应Ag,将抗原结合在微载体上进行的凝集试验叫“正向间接凝集试验”； 将抗体结合在微载体上进行的凝集试验叫“反向间接凝集试验”。,SPA协同凝集试验 葡萄球菌A蛋白（staphylococal protein A,SPA)是葡萄球菌的特异性表面抗原，能与多种动物IgG的Fc片段结合。特异性的IgG的Fc片段与SPA结合后，其Fab片段仍保持与特异性抗原结合的特点而发生抗原抗体反应，从而导致葡萄球菌的凝集。,桥梁凝集试验 又称Coombs抗球蛋白试验，用于检测不完全抗体。单价抗体只有一个抗原结合部位，不会产生凝集反应，当加入抗球蛋白抗体后，可以将两个各连结一个抗原决定簇的单价抗体再连结起来，出现凝集。,2.沉淀试验 可溶性抗原与相应抗体结合所发生的沉淀反应(precipitation)。 如细菌、寄生虫的浸出液、组织浸出液、培养滤液、动物血清等，与相应Ab相遇后在有电解质存在下Ag-Ab复合物相互交联形成免疫复合物达一定大时，可出现肉眼可见的沉淀反应。 沉淀抗原是细胞的浸出成分，为细微的胶体溶液，单个抗原的体积小而总面积大，出现反应需要的抗体量多 沉淀试验可分为环状/絮状沉淀试验、琼脂扩散试验、免疫电泳。,免疫电泳技术 将琼脂扩散试验与电泳技术结合起来的一种免疫检测技术。 在Ag、Ab在凝胶中扩散的同时加入电场作用，使Ag、Ab的扩散速度加快，同时限制了扩散的方向，增加了试验的敏感性。,Ag,Ab,-,+,3、补体结合试验,补体结合试验是可溶性抗原与相应抗体结合后，可以再结合补体，但这一反应不能被肉眼观察到，可加入红细胞及其抗体（溶血素），根据是否溶血来判定反应系统是否存在相应抗原抗体，如红细胞不溶解说明存在相应的抗原抗体，为阳性反应；如溶血则说明不存在相应的抗原抗体，为阴性反应。,检测系统 Ag + Ab Ag-Ab Ag-Ab-补体 + 补体 红细胞 + 溶血素 红-溶 指示系统,（不溶血，阳性）,红-溶-补体（溶血，阴性）,4. 标记抗体技术 标记抗体技术是在抗体球蛋白分子上，连接某一个特定的、容易检测的分子或原子 (标记物)，利用标记抗体能与相应抗原结合的特性，通过标记物的检测，从而确定抗原的存在部位。,标记抗体技术 =,免疫技术+标记技术,常用的免疫标记物质,类别 标记物 用途 荧光素 FITC、RB200等 免疫组化 免疫分析测定 酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定 金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定 放射性核素 3H、14C、32P、 57Gr、 125I、131I 免疫分析测定,4.1 荧光抗体,4.1.1原理：荧光素在紫外线照射下可发出肉眼可见的荧光，其与抗体结合后仍保持其本身的特性。 荧光抗体与相应抗原结合后，（1）通过荧光显微镜观察可测知抗原的存在及部位； （2）依荧光强弱也可测知抗原量的差异。,4.1.2 荧光抗体的标记 （）免疫球蛋白（ IgG ）的提取：硫酸铵盐析法、DEAE-纤维素提取法。 （）荧光抗体的标记：标记Ab常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC，为黄色或橙黄色结晶粉末，最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长520-530nm，呈现明亮的黄绿色荧光）和四乙基罗丹明（RB200，为橘红色粉末，最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595600nm，呈橘红色荧光）。 FITC的标记如下：,浓缩后的IgG、定量、稀释（1020mg/ml）. FITC按蛋白量的1/801/100加入。应用pH9.5的0.5M碳酸盐缓冲液将FITC进行溶解。 IgG稀释液与FITC溶液按:1配合，FITC液缓慢地加入到IgG稀释液中，防止出泡。 避光以电磁搅拌器搅拌，其反应时间与温度有关。 24须6h 2025须12h即可。 一般以低温标记为最好。 应用透析法、盐析、凝胶过滤法除去未结合的游离荧光素。,4.2.3 应用 主要用于检测抗原 （定性、定位） 特点：敏感，需荧光显微镜 直接法： 病料（Ag） 涂片（切片） F-Ab-Ag 镜检 间接法： 病料（Ag） 涂片 Ag-Ab1 Ag- Ab1-Ab2 -F 镜检,F-Ab,Ab1,Ab2-F,直接法 检测一种抗原就须标记一种特异性的AbF ，较特异 间接法 标记一种动物的免疫球蛋白AbF，就能检测多种抗原，较敏感,直接法 1、制片： 待检病理组织做成冰冻切片或触片，细菌材料可做成涂片，在室温中自然干燥，病毒抗原通常用冷丙酮固定l5min，细菌抗原则用加热固定即可。,2、染色： 滴加荧光抗体，置37染色3060min，用磷酸缓冲盐水 (PBS)充分洗涤以除去未结合的荧光抗体，加pH9.0缓冲甘油1滴，用盖玻片封固。 3、镜检： 在荧光显微镜下进行检查，抗原所在部位呈黄绿色荧光。,4、设对照： 进行直接荧光染色时，应设以下对照： （1）用荧光抗体染正常组织切片或触片应无荧光； （2）将待检材料先用未标记的抗血清处理，再用荧光抗体染色应不出现荧光。,间接法 1、制片：同直接法,2、染色：染色时，标本先滴加抗血清，在37处理3060min； 用PBS充分洗涤后，再用荧光标记的抗抗体染色，373060min，洗涤，封固。,3、镜检： 抗抗体必须与抗血清是相应的，如该抗血清是猪源的，则用兔抗猪荧光抗体。 4、对照： 需用正常血清处理作为对照，此对照片应无荧光。,肝脏,胸腺,肺脏,法氏囊,肠道,脾脏,食道,荧光抗体技术,4.2 酶标抗体,酶标抗体是指与底物结合后能显色的酶与抗体连接后所制备的结合物。 、原理：能与被检抗原形成酶标记的免疫复合物，免疫复合物上的酶在遇到相应的底物时，催化无色的底物，生成可溶性或不溶性的有色产物。根据有色产物的有无及浓度，可对抗原及抗体做定性、定位和定量测定。,、酶标抗体的制备 用于标记的抗体要求高纯高、高效价、与抗原的结合力强，以提取的IgG最为理想。 （）免疫球蛋白IgG的提取： （）酶标抗体的标记：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。 辣根过氧化物酶（HRP）常用的底物： 邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差。,标记的方法 a.交联法 以双功能交联剂为“桥”，分别与酶和抗体（抗原）连接形成结合物。如戊二醛交联法。 b.直接法 用过碘酸钠活化酶蛋白分子后，再与抗体（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）标记物制备。,NaIO法标记步骤: (1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。 (2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO溶液，室温下避光搅拌20分钟。 (3) 将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4过夜。 (4) 加20l 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化的RP的PH升高到9.09.5，然后立即加入10mg IgG(抗体)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。 (5) 加0.1ml新配的4mgml NaBH液，混匀，再置42小时。 (6) 将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4过夜。 （7）应用盐析、透析法、凝胶过滤法除去未结合的HRP。,免疫组化法： 应用酶标抗体对生物组织中的抗原进行鉴定和定位，称为免疫组化法。 酶联免疫吸附测定 (enzyme linked immunosorbent assay)简称ELISA： 用于可溶性抗原或抗体的定量，是一种既特异又敏感的方法。,酶标抗体的应用 免疫酶技术,其基本过程是将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶试验，底物显色后，用肉眼或分光光度计判定结果，其过程如下。,酶联免疫吸附测定(ELISA),间接ELISA：检测抗体 已知Ag 包被 加入待检Ab1 Ag-Ab1,加入Ab2-E Ag-Ab1-Ab2-E 底物，显色,Ag-Ab1,Ag-Ab1-Ab2-E,已知Ag,底物，显色,夹心法：先用抗体(IgG)被覆，加待检抗原，作用洗涤后，加酶标记抗体。,竞争法：用抗体被覆，加一定量的标记抗原和待检抗原混合物，二者竞争与板上的抗体结合，显色后与加标记抗原的对照组比较，试验孔颜色显著低于对照孔者为阳性孔，待检抗原含量越高，颜色越浅，此法适于小分子抗原或半抗原的检测。,二 抗？,抗抗体：抗异种动物的抗体，如兔抗猪二抗、兔抗鸡二抗。 用途: 酶标二抗 荧光标记二抗,兔抗猪高免血清的制备 免疫原：猪血清 猪IgG 制备程序：采取猪血、分离血清 提取IgG 取猪IgG接种于家兔（一般次，每次间隔天左右，剂量递增） 最后一次注射后左右采血检测其琼扩效价，达：以上时，大量采血，分离血清。,4.3 放射性核素标记技术,原理： Ag+AbR Ag-AbR 用液相闪烁仪测R放出的射线量 特点：敏感性极高，但需高级闪烁仪， 且同位素对人有放射性危害。,常用的核素有两大类： 射线： 131I、125I、57Cr和60Co 射线：14C、3H和32P。 使用最广泛的是：125I 性质活泼、易制备标记物 对被标记物的免疫活性影响小 测量方法简便、已推广 半衰期较长、核素丰度高,三、 免疫制备技术,抗原制备,抗体制备,抗体和细胞因子 纯化,完全抗原制备 人工抗原制备,血清抗体制备 单克隆抗体制备,硫酸铵盐析 离子交换层析 凝胶过滤层析 免疫亲和层析,用 途,类 型,用于免疫动物，检测抗体 用于免疫动物，检测抗体,用于检测抗原 用于检测抗原,初步提纯 进一步纯化 进一步纯化 高度纯化,抗体标记或致敏,免疫酶技术 荧光抗体技术 放射免疫测定 间接凝集试验,技 术,酶标记抗体 荧光标记抗体 同位素标记抗体 致敏抗体/抗原的制备,免疫血清的制备 为含有高效价特异性抗体的血清制剂。 常用的免疫动物 免疫的基本步骤,1.常用的免疫动物,兔子（rabbit）、鸡(chicken)：最常用于自制抗体，抗体量较多。 小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。 （BALB/C,昆明鼠） 大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大鼠） 羊（sheep、goat）：常用于较大批量地 生产抗体（商品）。 马（horse）：常用于大批量生产治疗用 抗体（商品）。,2.免疫程序 一般可分为基础免疫和强化免疫两个阶段。 基础免疫：一般先用弱毒苗/灭活苗按预防剂量进行首次免疫，经7天2周左右再用倍量同种疫苗进行二免，即完成基础免疫。有时还需进行3次以上的免疫。,强化免疫： 基础免疫后2-周左右开始进行高度免疫，注射Ag多为强毒，免疫原性良好，免疫剂量逐渐增加，免疫次数视血清抗体效价而定，一般1-2次。但有时需经过多次注射。每次注射强毒、Ag间隔时间为5-7天。,健康动物 首免（常规剂量） 二免（倍量同种疫苗） 高度免疫（强毒或灭活疫苗）,弱毒苗/灭活苗,1-2周,2-3周,注意： （）一般遵循剂量（抗原量）渐增，毒力渐强的原则 (弗氏佐剂除外）。 （）注射途径一般采用注射，最好采用分点注射，每一注射点Ag不宜过多。,弗氏佐剂免疫的基本步骤,基础免疫：首次，抗原用量大，用弗氏完全佐剂（Complate Freund adjuvand ,含矿物油,卡介苗等). 加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次，间隔2-4周，用弗氏不完全佐剂 (Incomplate Freund adjuvand , 不含卡介苗).,常用的佐剂,不溶性盐类胶体佐剂：氢氧化铝胶、明矾等。 氢氧化铝胶佐剂： 最简单的制备方法： AlCl3+3NaOH Al(OH)3+3NaCl 5份Ag液+1份铝胶 ，室温24天，弃去部分上清液，混匀分装。 钾明矾：KA1（SO4）2 .12 H20先配成10%溶液，应用时加入1-2%量与抗原混合。,油乳佐剂：油水不溶，但在乳化剂存在的情况下，高速搅拌可使二者形成乳剂而制成的佐剂。,油乳佐剂：油水不溶，但在乳化剂存在的情况下，高速搅拌可使二者形成乳剂而制成的佐剂。 剂型：油包水型、水包油型,水相（Ag）,油相,油相,水相,常用的油性佐剂有： A、白油佐剂 油相：94%白油、6%司本-80（去水山梨醇单油酸酯）、2%硬脂酸铝，加热、融化、高压灭菌。 水相：96%Ag液，4%吐温-80（聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯），混匀。 制苗时，将油相于匀浆机内，在低速搅拌下，缓缓加入水相（水相=1：2-3）后继续高速搅拌2分钟，制成乳白色的油包水型油乳苗，分装。,B、弗氏佐剂（Freund,s adjuvant ， FA） 弗氏不完全佐剂和完全佐剂 配方： 矿物油（石蜡油）3份 乳化剂（羊毛脂、吐温-80等）1份 磷酸缓冲液（PBS）4份 在此混合物中加入卡介苗（12mg/ml),即为弗氏完全佐剂,B2、弗氏完全佐剂（Freund,s complete adjuvant，FCA） 在FIA中加入卡介苗12mg/ml；或灭活的分支杆菌10mg/ml。用时佐剂与抗原等量混合。 卡介苗等分支杆菌细胞壁中的粘肽（胞壁酰二肽，MDP）具有很强的佐剂活性，它能活化巨噬细胞，在注射部位形成肉芽肿，吸引吞噬细胞，进一步增强吞噬细胞和淋巴细胞的活性，使其更易于捕获抗原。,在大多数情况下，免疫血清、杂交瘤细胞培养上清以及腹水中的抗体需经纯化后再用于各种免疫学检测中去。常用的纯化方法有盐析法、凝胶过滤、离子交换层析以及亲和层析等方法。这些方法各有优缺点，应根据抗体的特点、纯度要求和实验室具体条件加以选择。,血清抗体的分离与纯化,免疫球蛋白（IgG)的制备,1.盐析法 硫酸铵分段沉淀法,蛋白质是亲水胶体，在水溶液中形成水蛋白质结合物；当加入盐后，盐离子干扰蛋白质和水分子间氢键的形成（水盐结合比水蛋白质结合更稳定），从而使之失“水”而凝集，由此降低了蛋白质的溶解度而被沉淀析出。,盐析法原理,蛋白质在不同盐浓度的溶液中其溶解度不一样