《单克隆抗体技术》PPT课件.ppt

单克隆抗体技术,疫苗和抗体的研制，是生物技术发展的永恒主题。 目前在美国单克隆抗体类药物已占FDA所批生物药的3/4。,美国已上市16种单克隆抗体药物 2002年销售额 29亿美元 2005年 90亿美元 我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段，更谈不上抗体组药物的发展。,凝集细菌,抗体攻击病毒,抗体 是对其抗原有极强专一性 的 魔弹 或 巡弋飞弹,研 究 以免疫转印法检测 特定抗原 医 疗 以毒素连结抗体攻击 病变細胞 检 验 以 ELISA 侦测特定 病原体,抗体药物销售趋势图,生物技术,生物技术制药,基因工程药物（蛋白类药物）,人源化治疗性单克隆抗体药物,基因治疗技术,现代中药, 至2000年底，在美国药品市场上生物技术药物有76种，其中抗体药物有15种。 2003年治疗用单抗销售总额已超过52亿美元。 2006年预计50-60个治疗性单抗上市。 2010年预计单抗销售额200亿美元。 美国已占全球单抗市场90%一支独秀。 完全人源化单抗现有多个处于临床前阶段,多克隆抗体,Epitope, Antigenic determinant,抗原決定基, 一个抗原分子上可能有数个抗原決定基, 每個 抗原決定基 至少誘生一種專一性抗体, 蛋白质性 抗原決定基 含有六个以上氨基酸,整体水平抗体生成技术,细胞工程抗体生成技术,基因工程抗体生成技术,多克隆抗体（抗血清）,单克隆抗体,嵌合抗体、改形抗体,“小型化抗体”（单链抗体）,组合抗体库技术,噬菌体抗体库技术,Ig基因转基因小鼠,抗体真核表达技术,多克隆抗体（polyclonal antibody） 指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。 如:免疫血清（含多种特异性抗体）。 实际意义： （1）预防、治疗感染性疾病， 如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风， 胎盘球蛋白 抗病毒感染等 副作用：超敏反应 （2）临床诊断，如：肥达氏反应 - 伤寒、副伤寒 缺点：特异性差。,抗体体内生成的理论,抗原刺激前，机体具有抗体初级库 抗原刺激后，抗体生成的细胞群体被选择，并发生克隆性增殖。 在抗原的反复刺激下，抗体的V区发生高频率突变，产生高亲和力抗体的细胞被选择，抗体进行类别转换，最终抗体成熟。,传统抗血清,抗 原,免 疫,所有抗体混合,1,2,3,4,脾 脏,淋巴結,B 細胞,传统抗血清的交叉反应,专一性反应,沒有反應,交叉反应,+,-,?,1 2 3 Ag A,x y z Ag B,1 2 0 Ag A,单克隆抗体,杂交瘤技术的理论基础,淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性 利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb,可生产有用抗体的 淋巴細胞 若与 癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。,癌细胞 可培养生长,浆细胞 B cell 可分泌抗体,融合瘤 Hybridoma,细 胞 融 合,两组染色体混在一起,也可以培养生長 产生专一性抗体,一個 B cell 只 产生一种抗体,细胞DNA合成途经,1.替代途径：次黄嘌呤（H） HGPRT 2.主要途径： 氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸 谷 氨 酰 胺 （A-） 尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK 3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）,m,核酸补救合成,m,核酸从头合成,核酸,氨甲喋呤(A),(-),次黄嘌呤(H)胸苷(T),TK,HGPRT,TK-,HGPRT-,HAT选择培养基的原理,HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T),抗原免疫的脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞 （B细胞） （B细胞恶性肿瘤） 1. 抗体分泌（Ig+) 1.具永生性 2.HGPRT+在HAT生长 2.8-AG筛选出 HGPRT-株 PEG 融合 HAT筛选 脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞） （HGPRT+、Ig+）,融合的结果及命运,杂交瘤细胞,未融合的脾细胞,未融合的骨髓瘤细胞,脾-脾杂交细胞,骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞,免疫动物 培养骨髓瘤细胞 收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞 检测筛选阳性细胞 克隆化培养（反复3-5次） 获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水） McAb 纯化及鉴定,制备单克隆抗体的基本技术,1 抗原提纯与动物免疫 2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合 4 抗体检测 5 杂交瘤的克隆化和冻存 6 McAB的制备 7 单克隆抗体的纯化,抗体,-a,-b,-c,-d,-a -b -c -d,BALB/c,a,b,b,c,d,传统抗体 (抗血清) 是所有抗体的混和,脾脏产生各种 B 細胞,免疫前要先 把抗原作 成乳剂,免疫,抗原,采血后可得传统抗血清,已建立之小鼠 骨髓癌细胞株,由脾脏收集 B 細胞,抗原通常有多个抗原決定基,免疫后 的脾脏,约在两月內 注射五到八次,Ag X,免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。 可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次） 冲击免疫（融合前3天进行） 选用6-12周龄Balb/c小鼠,颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。,1,2,3,4,1,2,3,4,单抗,细胞融合,取出脾細胞,+ 癌細胞,各抗体分开,骨髓瘤细胞系选择要点： 稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP20、X63 等。 保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤） 防止支原体污染（胎牛血清） 融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95 融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中 常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞 饲养细胞一般在融合前一天制备,免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。 融合比例： 骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10 融合剂：40%PEG（分子量1000-2000） 融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液 2周后 改用一般培养液,细胞融合,Ag X,Ag X,ELISA,HAT,PEG Cell fusion,Hybridoma cells 融合瘤细胞,（Subcloning） (确定只有一种细胞),d,d,a b c d,a b c d,+ + + +,+ + + -,X,-d,-c,-b,-a,+,-,-d,分株培养筛选,筛选,单抗,传统抗体 (抗血清),试验专一性,对 抗 原 的 反 应,无 法 分 辨,完 全 不 同,一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。 可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。,克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。 克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次 克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法 阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染, 一个 B 细胞只能生产一种抗体，对付某一 抗原決定基。, 若有许多抗原決定基，则需许多株 B 細胞分別生产许多抗体。,B,B,B,Y,Y,Y,Y,抗 原,B,Y,B,亲和力成熟,1,1,2,3,4,抗原決定基,1,2,3,4,单抗生产的方法： 动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。,基因工程抗体,1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies),人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。,构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。,构建重组表达载体,克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。 人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。,人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。,2 鼠单抗可变区的人源化,尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。 CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。,经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体）,人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。 全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。,定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。,研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。,小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。 小分子抗体有很多优点: 可以用细菌发酵生产，成本低; 分子小，穿透力强; 不含Fc，没有Fc带来的效应; 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。,3 小分子抗体,Fv,ScFv,单区抗体,最小识别单位,Fab,由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。,(1)Fab,Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。,(2)Fv 或 ScFv,Fv,ScFv,连接肽,Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。 在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。 连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。,单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法; 在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中; 如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。,单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式: 一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性; 二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。,即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。,(3)单域抗体,VH,约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。,(4)最小识别单位,CDR,4 双特异抗体和多价抗体,双链抗体 （Diabody）一词最早由Hollinger等于1993年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。,双特异性抗体(bispecific antibody,BSAb)是指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原。另1种为对应效应成分。 即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。,Hollinger等巧妙地将抗原抗体的轻链可变区基因(VLA)与抗抗原抗体的重链可变区(VHB)通过短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中,构建成双链抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺反子。表达后,VLA VHB与VHA VLB交叉连结,形成双特异性抗体。,所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比,除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是肿瘤治疗的新突破。,抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。 PCR技术; 免疫球蛋白Fab片段在大肠杆菌中的成功表达; 噬菌体表面展示文库技术。,5 抗体库技术,初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。,它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P 或P相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对