《抗体的制备与应用》PPT课件.ppt

抗体的制备与应用 参考书： 1.医学免疫学纲要（研究生教材）。主编：章崇杰 。四川大学出版社。 2.医学实验技术的原理与选择（卫生部十一五规划教材）。主编：李幼平。人民卫生出版社。 免疫教研室 胡丽娟 immune_,Emil von Behring (1845-1917),antibody,-In 1890 by von Behring and Kitasato described an activity in serum of toxin-immunized animals that neutralized toxin. Transfer of immune serum could protect nave animals from diphtheria or tetanus.,History,Antibodies (Ab) are products obtained by antigen stimulating B lymphocytes, then B cells will proliferate into plasma cells to produce specific antibodies which can react specifically with corresponding antigens. Immunoglobulins (Ig) are all those globulins which have the function or structure of antibody. Two kinds of immunoglobulins: secreted immunoglobulins (sIg): Antibody membrane immunoglobulins (mIg): BCR,Day 0 2 4 6 8,Resting B cell,Antibody forming cell (plasma cell),Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Antibody Structure and Function,Structure of immunoglobulins,Basic structure Heavy chain and Light chain（重链和轻链） Variable region and Constant region（可变区和恒定区） Other structures Hinge region（铰链） Joining chain （J链） Secretory component (SC，分泌片) Domains （功能区）,peptide,peptide,epitope,binding of HV(CDR) and epitope,The function of Ig,V区的功能：特异性结合抗原（neutralization，中和作用） 抗体结合相应抗原分子，发挥免疫效应（生理与病理）； BCR特异性识别并结合抗原分子 ，介导体液免疫应答。,C区的功能 激活补体 Immune complex（IC） 激活补体经典途径 与细胞表面FcR结合 1）调理作用（opsonization)； IgG 或IgM的Fc段与吞噬细胞表面FcR结合促吞噬； 2）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 （Ab-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC) 3) 介导I型超敏反应 IgE的Fc段与肥大细胞表面FcR结合受体桥联细胞活化 穿过胎盘和粘膜 IgG通过胎盘；sIgA穿过粘膜,抗原是启动机体免疫系统的先决条件 Antigens are substances capable of stimulating immune system, generating antibodies and/or effector lymphocytes and binding specific with the antibody and effector lymphocytes in vivo or in vitro.,Immunologic properties of Ags,Immunogenicity 免疫原性,antigenicity /immunoreactivity 抗原性/反应原性/免疫反应性,刺激免疫系统,抗原决定基-抗原特异性的分子基础,抗原决定基（antigenic determinant) 指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。也称为表位(epitope)。 抗原决定基的位置、数目和空间结构决定抗原特异性。,T细胞决定基（T细胞表位）：T细胞决定基主要位于抗原分子内部，必须由APC将抗原加工处理为小分子多肽并与MHC分子结合，然后才能被TCR所识别。 B细胞决定基（B细胞表位）：BCR能直接识别未经APC加工的天然抗原，其识别的B细胞表位主要位于抗原分子的表面，与BCR具有易接近性。,根据抗原决定基由TCR还是BCR识别分类,主要内容,概述 多克隆抗体的制备与应用 单克隆抗体的制备与应用 基因工程抗体的制备与应用,概述,第一代抗体：多克隆抗体(polyclonal antibody，PcAb) 第二代抗体：单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb) 第三代抗体：基因工程抗体(genetic engineering antibody，GeAb),第一节 多克隆抗体的制备与应用 （polyclonal antibody，PcAb),概念：采用含有多种抗原决定基(B细胞表位)的抗原免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。 制备流程：免疫原（佐剂）免疫动物，分离抗血清，鉴定，保存。,传统抗血清 （多克隆抗体）,抗 原 (含多种表位),免 疫,1,2,3,4,脾 脏,淋巴結,B 細胞,多克隆抗体的优缺点,优点： 制备流程简便，操作技术要求低； 制备周期短，一个月左右就能获得目的抗体； 缺点： 制备的抗体是针对多种抗原决定基的混合物，特异性不高，易出现交叉反应； 抗体来源于动物，应用于人体会产生严重的过敏反应。 应用：主要用于免疫学检测，被动免疫治疗和紧急预防。其缺点限制了其在疾病诊断和治疗中的应用。,抗A,抗B,A,B,Cross reaction,Same epitope,第二节 单克隆抗体的制备与应用 (monoclonal antibody，McAb),概念：通过小鼠杂交瘤细胞和单克隆抗体技术生产的抗体。这种杂交瘤细胞既具有骨髓细胞能大量无限增殖的特性，又具有B细胞合成和分泌抗体的能力。每一个杂交瘤单克隆是用一个B细胞融合而产生的克隆，因此，由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的抗体，称为单克隆抗体。 制备流程：免疫融合筛选,单克隆抗体制备流程,杂交瘤技术的原理 1.亲本细胞的选择 小鼠骨髓瘤细胞：不产生Ig的重链和轻链；HGPRT-;TK-；与提供淋巴细胞的动物品系相同。能永生化。 备注：HGPRT:次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 TK:胸腺嘧啶激酶 免疫脾细胞：经抗原免疫的BALB/c小鼠的脾脏。不能永生化，但能分泌抗体， HGPRT+;TK+ 。,2. 细胞融合 骨髓瘤细胞 PEG 杂交瘤细胞 脾细胞 融合后细胞的类型: 未融合的脾细胞 杂交瘤细胞 未融合的瘤细胞,3.杂交瘤细胞的筛选,采用筛选培养基：HAT培养基 H-次黄嘌呤、A-氨基喋呤、T-胸腺嘧啶 只有融合成功的细胞（杂交瘤）才能在HAT培养基上长期生长，原因在于只有杂交瘤能成功合成DNA。,DNA合成途径,内源性途径（主要途径） 利用谷氨酰胺（Gln）或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下合成DNA (氨基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，因此能有效阻断DNA的合成)。 外源性途径（补救途径） 利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）或TK（胸腺嘧啶激酶）的催化作用下补救合成DNA,融合后细胞在HAT培养基中存活情况 脾细胞（HGPRT+, TK+, 能生长，但不能永生化） 骨髓瘤细胞（HGPRT-, TK-，不能生长 ） 杂交瘤细胞（HGPRT+, TK+ ，能生长，且能永生化）,4、杂交瘤细胞的筛选和克隆化 筛选： 免疫荧光 ELISA等 克隆化： 有限稀释法 单个细胞显微操作法 软琼脂培养法,配制方案：杂交瘤细胞（15）x106/ml) + 细胞冻存液(30%40% 牛血清，50%60% RPMI-1640培养液，10%DMSO ) “慢冻”：分步冷冻，30-70液氮 “快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、复苏,5. 杂交瘤细胞的冻存与复苏,6. 单克隆抗体的生产 体内：BALB/c小鼠体内诱发含有单抗的腹水 体外：无血清培养基悬浮培养等 7. 单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法 离子交换层析 A蛋白-Sepharose亲和层析,单克隆抗体（McAb）的优缺点 优点： 成分、结构均一，特异性强。一种McAb分子的所有区域完全相同，只针对一种抗原决定基，避免了交叉反应。 效价高 使用一种抗原免疫动物，可以获得针对不同抗原决定基的不同特异性的McAb。 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖、传代，因此产量高，可连续生产,缺点： 制备McAb成本昂贵，制备流程长，操作烦琐，技术要求较高。 McAb为鼠源性，应用于人体将产生人抗鼠抗体（Human anti-mouse antibody, HAMA）, 治疗中可能引起过敏反应且疗效大大降低。 抗体为全Ig，相对分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效杀伤浓度。,单克隆抗体在医学上的应用,（一）用作诊断试剂 1.检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化 阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。 2.鉴定病原体，准确诊断传染病。 3.用于肿瘤的诊断和分型 4.激素类单抗用于测定体内激素含量，判 断内分泌的功能状态,（二）用作研究工具 纯化抗原 分析和探查抗原结构 分析抗原决定基的功能 （三）用于疾病的治疗 抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治 抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗 抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗,单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题 单克隆抗体的特异性 由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应 异种抗体反应 鼠源性单抗用于人体，导致超敏反应 生产成本高,技术要求高，稳定性差，难于普及应用,第三节 基因工程抗体的制备与应用 (genetic engineering antibody，GeAb),概念：利用基因工程及蛋白工程技术，对抗体基因进行改造，按人们需要重新组装抗体或抗体基因片段，并转化适当的受体细胞后表达的规模化抗体。 基本原理：利用分子生物学技术分离纯化抗体基因或基因片段，在最大限度保留其抗原结合活性，降低其异源性的原则指导下，按临床或科研需要对抗体基因进行拼接组装，在转化适当的受体细胞表达，制备具有不同大小和不同功能的抗体。,基因工程抗体产生的时代背景 1、单克隆抗体的毒副作用 2、人杂交瘤技术未获真正突破:融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫 3、现代免疫学和分子生物学技术的推动 4、基因工程抗体的优点,基因工程抗体的优点： 易于获得稀有抗体; 人抗鼠抗体反应（Human antimouse antibody reaciton, HAMAR）低; 小分子抗体：渗透力强、HAMAR低、亲和性高、靶向性高、组织非特结合少等。,基因工程抗体的分类 1、全抗体 （1）嵌和抗体（chimeric antibody） （2）人源化抗体（humanized antibody） 2、小分子抗体 （1）Fab （2）ScFv （3）单域抗体 （4）分子识别单位,3、其它抗体,多价微型抗体 双链抗体（diabody） 微型抗体(minibody) 三链抗体(triabody) 新型抗体分子 新效能抗体 双特异性抗体（bispecific antibody,BsAb） 胞内抗体（intrabody） 免疫黏连素（immunoadhesin） 催化抗体（catalytic antibody）,一、基因工程全抗体,基因工程全抗体研发的演变历程,鼠抗体 100% 鼠源,鼠/人崁合抗体 (66-75 % 人源),人源化抗体 (90-95 % 人源),100% 人源,（一）嵌和抗体（chimeric antibody) 1、概念 指由两种不同种系来源的基因所编码的抗体。 2、原理 从鼠源的单克隆抗体杂交瘤细胞株分离并鉴定抗体V区基因，再通过适当的技术将其连接到人抗体C区基因上，构建Vm（mouse）-Ch（human）嵌和基因，并转入适当的受体细胞表达。,嵌合抗体,3、嵌和抗体的优缺点： 优点： 特异性强 亲和性高 具有全抗体的所有功能 半衰期长、疗效显著 缺点： 有1050%发生HAMA 靶向性差,（二）人源化抗体（humanized antibody） 1、概念 指利用基因工程技术，在嵌合抗体基础上，针对嵌合抗体仍然具有较高的HAMA反应的问题，进一步对抗体进行CDR及FR区域置换。通过这种方式获得的抗体人源部分可达97%，又称为CDR移植抗体（CDR grafting antibody）。 2、原理 首先利用计算机模建技术，模拟抗体立体结构。再根据同源性原理从人抗体基因库中筛选人FR序列。通过分子模拟技术鉴别出与抗原结合位点密切相关的鼠单抗FR上氨基酸残基，将这些残基与CDR重组并一同移植到人FR上。,3、方法 在抗体可变区，具有较高变异的是位于超变区内（互补决定区，CDR）少数核心氨基酸，它决定了抗体的特异性，而可变区中的“框架区（FR）”则决定了可变区的三维空间结构。 通过同源蛋白三维结构模建技术预测抗体可变区三维结构后，对鼠及人VH、VL表面容易引起较强免疫反应的氨基酸进行比较分析，进行人源化分子设计。,二、基因工程小分子抗体,小分子抗体,1Fab 抗体片段 2单链抗体（single chain Fv, ScFv） 3单域抗体（single domain antibody） 4分子识别单位（molecular recognization unit, MRU）,（一）Fab抗体 由V链的VH、CH1及完整的L链构成,优点： 分子小，HAMAR低 亲和性高 靶向性高于McAb 缺点： 仍然有一定的HAMAR发生 靶向性不如ScFv 稳定性差,（二）单链抗体（ScFv） 概念 是指通过特定的方法将抗体分子VH和VL连接在一起构成的只有一条链的抗体。 优点： 克服了HAMAR的问题 分子量小、渗透性高，靶向性增加 ScFv可保留较高活性 在体内半衰期长、稳定性高 没有Fc段，非特异结合减少，在肿瘤导向治疗及成像诊断中有特别的意义,类型 （1）二硫键稳定的单链抗体(dsFv） （2）由连接肽连接的单链抗体（ScFv）,1、dsFv（二硫键稳定的单链抗体） 利用基因突变技术在VH和VL上加入半胱氨酸，利用两者形成的二硫键将VH和VL连接在一起。 突变部位的确定：由Jung等人在1994年用分子模建技术确定：VH44/VL100及VH105/VL43。,2、ScFv（由连接肽连接的单链抗体）,Linker的设计原则 长度和性质以不干扰VH和VL的折叠和不影响抗原结合部位的功能为标准。过短的接头会影响VH和VL之间的相互作用，过长的接头会影响抗体与抗原的结合，而且易受酶水解，不稳定。接头中尽量不含疏水氨基酸。常采用3次重复出现的4个甘氨酸和1个丝氨酸即（Gly4Ser）3, 的15氨基酸接头。,（三）单域抗体,只有一个VH或VL的抗体，通常为VH,（四）分子识别单位,只有一个CDR，通常为CDR3,三、其它基因工程抗体,多价微型抗体 双链抗体（diabody） 微型抗体(minibody) 三链抗体(triabody) 新型抗体分子 新效能抗体 双特异性抗体（bispecific antibody,BsAb） 胞内抗体（intrabody） 免疫黏连素（immunoadhesin） 催化抗体（catalytic antibody）,（一）多价微型抗体,1双链抗体（diabody） 2微型抗体(minibody) 3三链抗体(triabody),1双链抗体（diabody）,双链抗体是通过化学铰链、黏性蛋白结构域融合法和接头长度控制三种主要手段将两个ScFv通过非共价键结合形成刚性、稳定的二聚体结构。具有两个抗原结合位点，分子量约60KD。具有穿透力强的优势，易于通过血管壁进入实体瘤。与ScFv比较，其肾脏的清除速度减慢。具有更大的临床应用价值。,2微型抗体(minibody),采用基因工程的手段，使用不同的接头把单链抗体(VL-VH)的VH功能区与IgG的CH3功能区融合，构成VL-VH-CH3的融合蛋白，称之为微型抗体（minibody）。该抗体合成后通过CH3功能区形成稳定的二聚体，发挥其双价抗体的作用。微型抗体的分子量约为80KD，较双链抗体(约60KD)的大，降低了体内清除速度，增加了滞留时间。此抗体具有（Fab）2的类似性质，但没有（Fab）2需对完整抗体进行酶切消化及二次纯化的繁琐过程，是一种较为理想的基因工程抗体形式。,3三链抗体(triabody),制备单链抗体时，把接头的长度降2个或2个以下氨基酸残基，或者直接把VH功能区的N末端与VL功能区的C末端相连，这样可通过非共价键形成三聚体，称为三链抗体。 VH和VL直接连接构成无连接肽（ScFv-0）三聚体的亲和力高，其与抗原结合比较牢固，解离速度慢。,（二）新型抗体分子,1新效能抗体 2双特异性抗体（bispecific antibody,BsAb） 3胞内抗体（intrabody） 4免疫黏连素（immunoadhesin） 5催化抗体（catalytic antibody）,1新效能抗体,通过基因拼接、化学交联等多种方法，将抗体分子与酶、化学药物、放射性核素、生物毒素、超抗原等相结合。通过抗体发挥导向或载体效应，使抗体携带物靶向结合于特异细胞上，发挥抗体携带物的效应功能。,2双特异性抗体（bispecific antibody,BsAb）,又称双功能抗体（bifunction alantibody,BFA），具有两个能结合不同特异性抗原位点的抗体。具有小分子抗体低副作用，又能有效促进细胞或分子聚合，介导高效生物学效应，在肿瘤、病毒感染治疗中具有较大优势。,3、胞内抗体（intrabody),概念： 利用基因工程技术，在ScFv抗体基因的C端或N段加上先导序列，使抗体分子定向分布于非淋巴细胞的细胞核、细胞浆或某些特定的细胞器中表达，从而特异性干扰或阻断分布于该部