共聚焦激光扫描显微术ppt课件

共聚焦激光扫描显微术 及其在生物医学中的应用,姚忠祥 ,一、概述,共聚焦激光扫描显微术(Confocal Laser Scanning Microscopy ,CLSM) 特点： 1.显微镜成像 2.激光扫描 3.计算机图象处理,简史: 马文.闵斯基 (Marvin Minsky) 1957 （美国专利） 矛 盾：成像质量、扫描速度 狭缝扫描:成像质量不佳 台阶扫描:光栏不动，移动工作台标本 光束扫描：现通用,二、基本原理,1.光学成像 激光器产生的激光经物镜聚焦到样品上 反射光或荧光经目镜汇聚于探测器 探检测器前有一小孔(Pinhole)汇聚光束,2.成像保存 以电信号形式储存， 可以进行图象分析（参数、伪彩、值等）。 3.共轭(confocal) 是指光源孔和检测针孔对物镜焦平面是共轭的。,宽场照明显微镜和共聚焦图象比较,三、CLSM的应用,展现最清晰图象细节,图象处理功能 1.光学切片功能：显微CT 微动进步马达最小步距0.1um 2.三维图象重建：3D软件 X，Y，Z轴重建，立体旋转,3.荧光物质的定位，定量与动态测量（单标、双标、多重标记）,高速采集,Dronpa蛋白,FRAP光漂白,Folu-EGFP-EB3,Tubulin,Actin,线粒体,4.细胞内PH及Ca,Na等离子定位、双标记组合、OD值与免疫细胞组化、原位杂交技术相结合,细胞生物学功能 1.粘附细胞的分选：物理化学特性，细胞亚群 2.激光细胞显微外科及光陷阱(optical trap)技术： 激光刀：细胞穿孔、灼烧细胞器、切割染色体、切除神经细胞突起 光陷阱：利用激光的增强效应，钳制或移动细胞器、染色体，进行细胞融合、改建、神经丝去除,3.荧光漂白恢复技术(Fluorescent Redistribution After Photobleaching,FRAP) 高浓度脉冲使细胞某一区域荧光淬灭，记录周围非淬灭荧光分子扩散至淬灭区的时间，了解细胞连接的多少、细胞骨架的组装等 荧光标记物：CFDAam 细胞间通讯连接的影响因素：PH,Ca2+ ,cAMP等,FRAP荧光粹灭漂白恢复法 举例,荧光染料：二乙基羧化荧光素 (carboxyfluorescein diacetate，CFDA) 标本：大鼠膀胱逼尿肌细胞（细胞培养） 分组：实验组，可见荧光恢复现象 干预组（加GJ阻断剂），无荧光恢复现象 观察时间：光漂白后0，2，4分钟,A,B,C,D,A,B,C,D,4、膜流动性的测定 细胞膜荧光探针受到极化光的刺激激化后， 发射光的极性依赖于荧光分子的旋转， 而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围膜流动性， 故极性测量可以反映膜的流动性,5.光活化技术或称光笼锁（caged）化合物技术 笼锁化合物又称光致不稳定笼锁化合物(Photolabile caged compounds)， 通过基团修饰以掩蔽生物活性分子，使其以惰性前体形式存在。通常是可逆的。 原理：紫外线照射共价键断裂释放生物活性分子,笼锁化合物的两种光化学反应原理： 偶氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光致分解作用,1.偶氮苯衍生物： 偶氮苯衍生物具有顺式和反式立体同分异构体，其药理性质不同， 并可用不同波长光照以控制两种同分异构体间的转化。 早在经典的笼锁化合物问世以前，已有乙酰胆碱激动剂与偶氮苯结合生成光敏物质Bis-Q。 Bis-Q顺式无活性，用420-440nm光照后即转化成反式而激活，再经过340nm光照后又变成顺式。 Bio-Q与电生理技术结合用于研究电鳗和电鳐的乙酰胆碱受体。,2.邻硝基甲苯衍生物： 目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯的光敏性质合成。 当生物活性分子与硝基甲苯结合即暂时失活，故又将后者称为掩蔽基团或笼锁基团。 一旦受到光照，连接于侧链碳原子的前体即解离而释放出活性分子、质子和亚硝基副产物。,笼锁神经递质、调质及抗体 例：光照解笼锁 NPE-氨甲酰胆碱血管平滑肌收缩（氨甲酰释放） Caged入Cell途径：诱入法，酯化法，电极导入法，膜片钳全细胞方式导入法,CLSM的优点,1.激光是单色光、LM观察、荧光观察 2.推进器步距达0.1um（“显微CT”） 3.图象以电信号形式记录、储存，可修饰伪彩、测定细胞参数，直接获得图象 4.图形经精细调焦的光束成像，清晰度高 5.可活体观察、动态观察,四、CLSM 使用步骤,（一）样品准备 培养细胞，如用钙Fluo-3可用市售培养皿 紫外激发，Fluo-2,0.2um盖玻片制成培养瓶底 活组织切片：甘油封片，无自发荧光,（二） 选择荧光探针 1000余种 钙：Fluo-3/am(水溶性)不用紫外光激发，可渗透细胞。Fluo-2用紫外激发，不穿透，需用Microinjection 观察细胞内PH：Snarf荧光素中插入萘而合成，可与Fluo-3或Fluo-2联合测定细胞内钙与PH,CLSM常用荧光探针,细胞内钙：Fluo-3,Rhod-1,Indo-1,Fura-2 DNA & RNA:碘化丙锭PI,吖啶橙AO 膜电位：DiBAC4 PH值：SNARF类，疏水性探针用Am形式 细胞间通讯：6-carboxyfluorescent diacetate,6-CFDA 细胞内活性氧；H2DCFDA Immunocytochemistry multipole staining,DNA chip：Cy3,Cy5,CY3 red CY5 Green,Living dye-Green Fluorescence protein(GFP),下村脩(Osamu Shimomura)1962年从一种水母身上分离出绿色荧光蛋白(GFP),绿色荧光蛋白GFP分子结构图,GFP是一种由238个氨基酸构成的柱状蛋白。 外围由折叠片围绕， 内部则是一个线状的-螺旋通过其长轴从中间穿过。,Douglas Prasher 1992年克隆出了GFP基因,当GFP受紫外光或蓝光激发时，-螺旋包含的发色团会发出绿色荧光。 由于这一特点及其无种属限制，GFP作为荧光标签被广泛用于细胞水平上的监测生物活动。,2008诺贝尔化学奖由下村脩(Osamu Shimomura)、Martin Chalfie 和钱永健 (Roger Tsien)三人分享，代表了绿色荧光蛋白研究上的三个里程碑,在GFP基因上突变几个不同的位点形成增强型绿色荧光蛋白(enhanced GFP,EGFP),黄色（EYFP）, 黄绿色（ECFP）和兰色（EBFP）的活体荧光蛋白。 这些荧光蛋白都具有稳定、无细胞毒性、灵敏度高,不需反应基质（substrate）等优点,又称为单标记系统（single tag system）。,The Discovery of Aequorin and GFP,标记CFP和GFP的脑皮质神经元,小鼠脑部邻近神经元可以随机表达不同颜色的GFP(称之为XFPs),转染pEGFP载体后24h可见神经干细胞集落内有少量GFP阳性细胞。 (荧光+普通光相差显微镜100倍),加血清48h后，神经干细胞集落内和周边均有GFP阳性细胞。 (荧光普通光相差显微镜，荧光相差显微镜400倍),最重要是能用于活细胞和蛋白质进行实时定位和观察，不需特殊的激发光谱，故又将此组荧光蛋白称为自动荧光蛋白(autofluorescent proteins,AFPs)。 红色荧光蛋白(RFP)是从海产的IndoPacific sea anemone relative Discoma Striiata 中分离的一种独特的显示红色荧光的蛋白质，故又名为DsRed。,1.神经细胞参数测定及三维重建 细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 神经骨架重组的研究,五、在神经生物学的应用,2.神经递质、调质及细胞内活性物质受体的荧光定位 3.细胞内钙离子的测定 细胞内信号传导的研究 钙内流与神经递质释放的关系 微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释放 4.细胞内PH值的测定，脑缺血，损伤时细胞内PH变化,5.荧光漂白恢复技术(FRAP)与细胞间通讯研究 Gap junction的分布，密度，调控因素，网络阻断剂(Othanol , Dieldrin) 6.激光手术切除神经细胞突起 光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体 7.神经细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD) 与细胞内钙的关系 与细胞内PH的关系,划痕负载法计算公式,红色：大分子RB200 绿色：小分子Lufic YELLOW RB200只可通过划痕处损伤细胞膜进入 Lyellow可通过划痕及Gap Ju