微生物的纯培养和显微技术ppt课件

微生物学教程,主讲教师：熊强 E-mail:,第2章 微生物的纯培养及显微技术,一、微生物接种技术,（一）基本原理 微生物的接种技术是生物科学研究中的一项最基本的操作技术，选择一个好的接种方法，对微生物的分离、纯化、增殖和鉴别都很重要。 接种方法：斜面接种、液体接种、穿刺接种 、固体接种、三点接种,为了确保纯种不被污染，在整个过程中，必须进行严格的无菌操作。,（二）实验材料,1. 菌种：大肠杆菌（E.coli）、酵母菌、放线菌、产黄青霉。 2. 培养基：营养琼脂斜面和平板、肉汤蛋白胨培养液（试管）、半固体肉汤蛋白胨直立柱、PDA斜面和平板。 3. 接种工具：接种环、接种针、涂布棒等。 4. 其他：吸管、酒精灯等。,1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀,（三）常用接种和分离工具,（四）实验方法,无菌操作环节 在微生物实验中，一般小规模的接种操作，使用无菌接种箱或超净工作台，工作量大时使用无菌室接种，要求严格的在无菌室内再结合使用超净工作台。 （1）接种室应经常打扫，拖地板，用煤酚皂液擦洗桌面及墙壁，用乳酸或甲醛熏蒸接种室。 （2）接种室或超净工作台在使用前，应先打开紫外光灯灭菌半小时。,（3）经常对接种室作无菌程度的检查。 （4）进入接种室前，应先做好个人卫生工作，换工作鞋，穿上工作衣，戴口罩。工作服、口罩、工作鞋只准在接种室内使用，不准穿着到其它地方去，并定期洗换和消毒灭菌。 （5）接种的试管、三角瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称，日期。移入接种室内的所有物品，均须在缓冲室内用75%酒精擦拭干净。,1.斜面接种,由已长好微生物的斜面中挑取少量菌种接种至另一空白斜面培养基上。,斜面接种时的无菌操作 (1)接种环灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种，灼烧管口 (6)塞好棉塞，接种环灼烧灭菌。,2. 液体接种 （1）由斜面培养基接入液体培养基 此法用于观察细菌的生长特性和生化反应的测定。操作方法与前相同，但使试管口向上以免培养液流出。接入菌体后，使接种环与管内壁轻轻研磨，使菌体擦下。接种后塞好棉塞，将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。 （2）由液体培养基接种液体培养基 菌种如为液体时，接种除用接种环外，常用的还有无菌吸管或滴管。只需在火焰旁拔去棉塞，将管口通过火焰，用无菌吸管吸取菌液注入培养液内，摇匀。,3.三点接种法 要获得霉菌的单菌落，宜在平板上用三点接种法接种。即用接种针沾取少量霉菌孢子，在琼脂平板上点成等边三角形的三点。经培养后，每皿形成三个菌落。其优点不但在一个培养皿上同种菌落有三个重复，更重要的是在菌落彼此相接近的边缘，常留有一条狭的空白地带，此处菌丝生长稀疏，较透明，还分化出稀落的典型子实器，因此可以直接把培养皿放在低倍镜下观察，便于根据形态特点进行菌种的鉴定。这是单点接种法所难以做到的。,穿刺接种 （a）水平穿刺接种（b）垂直穿刺,4. 穿刺接种 把菌种接种到固体深层培养基中，此法用于嫌气性细菌接种或为鉴定细菌时观察生理性功能。 操作方法右图，所使用的接种针要挺直。 将接种针自培养基中心刺入，直到接近管底，但勿穿透，然后沿原穿刺途径慢慢拔出。,二、微生物的纯培养技术,1.划线分离法 倒平板划线培养挑单菌落纯培养,注意：每划完一个区域，要灼烧接种环，用力要轻勿划破表面。,平板划线法,用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次划线12条，再转动培养皿约70角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。,将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。,常用的两种划线方法：,2. 稀释分离法,取稀释好的菌悬液0.1mL加入平板中，将冷却至45左右的琼脂培养基倒入平板中约10-15mL。迅速旋转培养皿,使培养基和稀释液充分混合,水平放置,待凝固后,倒置于到恒温培养箱中培养。,方法一: 倾注平板法,方法二: 涂布平板法,加样: 将稀释好的菌悬液0.1mL加入琼脂平板中。 涂布: 右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。待涂布的菌液干后,倒置于到恒温培养箱中培养。,涂布法,划线法,三、显微镜的使用,一、目的和要求,1、普通台式显微镜的结构和各部分 的功能及使用方法。,2、油镜的工作原理及使用方法。,几个基本概念：,放大 分辨率 反差,被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！,能辨别两点之间最小距离的能力,被观察物区别于背景的程度,与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微 镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。,1.显微镜的结构,基本结构,机械系统,光学系统,由镜座、镜臂、载物台、转换器、调节装置等组成。,由物镜、目镜、聚光器、光源等组成。,显微镜的机械系统,显微镜的光学系统,0.61 l 分辨率D（最小可分辨距离）= NA,2.显微镜的原理,NA ：数值孔径,是指介质的折射率与镜口角12正弦的乘积，可用 NA= n sin(/2) 表示。,n为物镜与标本间折射率；为镜口角（通过标本的光线延伸到物镜前透镜边缘所形成的夹角）。,物镜的镜口角 1.物镜 2.镜口角 3.标本面,显微镜的优劣主要取决于物镜分辨力的大小。,D值愈小表明分辨力愈高。 D值可用下列公式表示：D=0.61/NA,缩短光的波长,增大物镜的数值孔径,普通光学显微镜的缺点是所用的照明光源不可能超过可见光的波长范围(约400700nm)。,其影响因素之一是镜口角,当sin增大到最大时，值900，就是说进入透镜的光线与光轴成900角，这是不可能的，所以：sin(/2)的最大值总是小于1。,现在所用的油镜其为600左右。影响数值孔径的另一 因素是介质的拆射率，不同介质的折射率是不同的。,光线在穿过折射率不同的介质时发生折射,很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。,用浸没油取代空气的作用：,介质折射率提高,数值孔径值和分辨率均得到提高,浸没油与玻璃的折射率相近,因此，通常在物镜和标本之间加入香柏油作介质就可使数值孔径(NA)值增大到1.2-1.4。所以，当用数值孔径为125的油镜来观察标本时，就能分辨出距离不小于0.2m的物体，而大多数细菌的直径在0.5m左右，故在油镜下能看清其细微形态及某些构造。,空气的折射率为1.0 水的折射率为1.33 香柏油的折射率为1.62 玻璃的折射率为1.5l,光学显微镜物镜的特性,人眼的分辨能力在0.2 mm左右，因此光学显微镜的最大有效放大倍数（使用油镜）是1,000到1,500。,显微物镜的主要参数,3.具体操作,（1）观察前的准备,1.拿取显微镜,2.调节光源,3.调节光轴中心,(2)低倍镜观察,要养成必须先用低倍镜观察的习惯。将标本制片放置载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正上方，转动粗调节旋钮，使物镜降至距标本0.5cm处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒或下降载物台，直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。移动标本，找到合适的目的物并将它移到视野中央，进行观察或为下步进行高倍镜观察用。,（3）高倍镜观察,在转换物镜时要从侧面观察 。然后从目镜观察，调整光亮适度，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升或镜筒下降，且至物像出现，再用细调节旋纽调至物像清晰为止。找到需观察的部位，并移至视野中心进行观察或准备用油镜观察用。,（4）油镜观察,用油浸物镜时要特别细心，避免由于调焦不慎而压碎标本制片，而物镜也受到损害。必须按下列步骤操作： 1）先用粗调旋旋钮将镜筒提升(或将载物台下降)约2cm、再转换油浸物镜至中央； 2）在玻片标本的镜检部位滴一滴香柏油； 3）从侧面注视，用粗调节旋钮将镜简缓慢地下降(或上升载物台)，使油浸物镜浸入香柏油中，其镜头几乎与标本接触。 4）从接目镜内观察，调节细调节旋钮直至物象清晰。若镜头已离开油面仍未看到物象，必须再从侧面观察，浸入镜头，重新操作。,上升镜筒，转动物镜转换器，使油浸物镜偏位；,先用擦镜纸擦去镜头上的油；,再用擦镜纸蘸少许二甲苯，擦去镜头上残留油迹；,最后再用擦镜纸擦拭残留溶剂即可。,（5）观察完毕，油镜的维护,将各部分还原，转功物镜转换器，使物镜头不与载物台通