RTCA技术原理及应用.pptx

郑 敏,xCELLigence技术的原理 及其应用简介,杭州高通量新药筛选中心 浙江大学医学院附属一院,简介 传统基于细胞水平的研究方法的局限性 ACEA公司的解决方法 技术平台:基于微电子传感器技术，通过实时监测阻抗的变化来进行实时的细胞分析 操作原理:实时细胞分析 我们监测的指标 xCELLigence 系列产品 RTCA检测的特点 应用范例 独特的应用：RTCA心脏系统 总结: RTCA技术的优势,xCELLigence技术介绍大纲,传统细胞毒性/活力检测方法工作原理及检测流程,细胞,培养,MTT,CVKT,加入MTT,孵育,加入有机溶剂,孵育,加入CVTK,孵育,测吸光度,数据处理分析,单个时间点信息 结果反复，不稳定 新的未知蛋白/药物/基因的作用 难以优化条件 耗费大量时间，经费重复实验，优化条件 没有直观信息做问题分析,DNA Damaging,DNA Damaging,RTCA实时动态监测细胞毒性反应检测流程,细胞接种,细胞增殖,外界因子加入,细胞效应,RTCA,MTT,实时,无标记,全自动,细胞毒实验-传统终点 VS 实时无标记检测,微电子阻抗感应器在细胞生物学中的应用,Z,Z = Z0,Z = Zcell,Add Cells,electrodes without cells,检测原理 基于微电子阻抗技术的细胞检测技术,Z,细胞指数和细胞数的关系,16000,8000,500,1000,2000,4000,125,250,Cell Number,Cell Number,Cell Index,8.3,4.6,1.9,0.9,0.51,0.3,0.22,0.13,Cell Index,0 min,5 min,20 min,细胞指数和细胞粘附力及形态的关系,xCELLigence系统系列产品,RTCA 1*96,RTCA 6*96,RTCA3*16&CIM,RTCA 1*384,RTCA,RTCA HT System,RTCA Cardio Instrument,xCELLigence系统系列产品的匹配电子板,时间点选择在细胞试验中重要性,不同的细胞状态对于处理因素有不同的反应 RTCA系统使接种细胞后的对于细胞的检测可持续进行 RTCA 为最佳处理时间的选择提供了依据,Traditional Cell Analysis Method,RT-CA Assay,不同时间点肿瘤细胞对抗肿瘤药物的反应性,Vehicle 33 nM 67 nM 100 nM 150 nM 230 nM 340 nM 500 nM,xCELLigence 系统的应用,细胞增殖和细胞毒性试验 细胞贴壁和铺展 受体-配体间相互作用 RTKs GPCRs IgE receptor NK细胞介导的杀伤肿瘤细胞 肿瘤细胞的迁移和侵袭 siRNA 文库筛选 心脏细胞功能和毒性监测 病毒CPE及中和实验的监测 细菌毒素介导的细胞病变的监测 ,利用 xCELLigence 系统进行细胞质控,A549,PC3,“HeLa” 细胞生长曲线 来源于4个不同的实验室和ATCC,ATCC,Lab 1*,Lab 2*,Lab 3,Lab 4,* These labs were from the same institute,应用 xCELLigence 系统研究TCRP,Staurosporine,5-Fluorouracil,Time dependent cellular Response Profiling，TCRP 时间依赖的细胞反应特征性图谱,TCRP with Known Mechanisms,Short-Term Response,Long-Term Response,Anti-mitotics,Protein-Synthesis,DNA Damaging,Nuclear Hormone,HDAC Inhibitors,Serotonin Receptor Antagonist,L-Type Voltage-gated Ca Channel Inhibitor,Anti-Histamine,Short-Term Response,Long-Term Response,Anti-mitotics,Protein-Synthesis,DNA Damaging,Nuclear Hormone,HDAC Inhibitors,Serotonin Receptor Antagonist,L-Type Voltage-gated Ca Channel Inhibitor,Anti-Histamine,TCRP with Known Mechanisms,利用TCRP进行药物筛选,Seed 4000 A549 Cancer Cells in 96 well E-Plates,Treat with Compounds at a final concentration Of 20 mM,Monitor the cellular response for 48 hours,Compare cytological profiles,E-Plate,Add Cells,Add Compound,Real-Time Continuous Monitoring,Monitor 20-24 hours,Monitor 48 hours,Impedance-based real-time cellular response profile,Interdigitated gold microelectrodes,Spectrum Compound Library from MS Discovery (Collection of FDA approved drugs, nature compounds Experimental compounds, insecticides and herbicides),ACEA Biosciences Confidential Information,ACEA Biosciences Confidential Information,0 1 10,TCRP 聚类分析,ACEA Biosciences Confidential Information,0 1 10,TCRP 聚类分析,RTCA技术的优势,无需标记 可以节约因标记带来的时间和花费 不改变研究对象的性状,使研究过程更为简便及实现自动化 不需要知道明确的作用靶点，可实现多功能的检测 实时动态监测: 高质量、更多的信息量 New insights from easy-to-achieve kinetic (real-time) measurements. 持续的细胞质控 非创伤性的检测: 更接近生理状态 检测后的细胞还可用于其他的检测方法 准确性高,可针对不同通量检测,实时无标记细胞表观分析在肿瘤研究中的应用,增殖及细胞毒性 迁移及浸润 肿瘤与微环境-共培养 信号通路 肿瘤免疫-细胞免疫,肿瘤分子机制研究及治疗探索的细胞学基础,分子机制研究,治疗探索,实时无标记细胞功能分析 （RTCA),27,应用专辑一案例,图1A. RTCA实时动态检测细胞活力。HeLa 细胞接种于E-Plate 96 电极板，培养24h之后用不同化合物处理：MG-132 (3.3 M), 阿霉素 (0.33 M), 长春新碱 (6.2 nM) 及5-FU (11.1 M) ，未经化合物处理的细胞作为对照组。每隔15min检测一次细胞指数，持续检测64h。曲线代表所有重复样品的平均值，误差线为标准偏差。 图1B. 细胞指数和WST-1分析结果对比。实验结束时（图1A所示），即加药后64h，加WST-1染色分析。细胞指数和WST-1分析结果对比，结果展示为试验组相对于对照组的倍数变化，柱状图显示所有重复样品的平均值，误差线为标准偏差。,此图给药组曲线刚刚为零时，测定凋亡的结果较好。此例的切入点是我们的仪器可以通过完整的药时曲线，帮助选择流式检测凋亡的最佳时间点，提高流式检测凋亡的效率及准确性,应用专辑一案例,RNase L高表达抑制细胞增殖。在低表达核糖核酸酶RNase L的Hela细胞系中稳转RNase L基因构建成高表达RNase L 的Neo/RNase L克隆细胞，稳转空载Neo作为对照组。将两类细胞系5x103/孔接种至96xE-Plate上，设4个副孔。RTCA实时动态动态监测细胞增殖情况，每隔20min检测一次，持续检测5天。结果显示，核糖核酸酶RNase L过表达抑制细胞增殖。,此例说明对于转染目的基因到对象细胞中考察对细胞增殖影响，传统方法需要在筛选1-2周后，重新增殖到数量够铺96孔板，大概需要1-2周时间，这段时间转染后的细胞可能会发生变化，结果不准。那么我们的仪器最低只需要125cell/well，因此可以在筛选后，直接铺细胞进行增殖实验，因此，可以省下一半的时间，而结果准确。,浸润与转移是恶性肿瘤两大特点,浸润与转移的可能机制 肿瘤细胞同质型粘附力降低 瘤细胞异质型粘附力增加 细胞外基质降解 瘤细胞的运动能力 肿瘤转移相关基因及抑制基因 局部组织器官的特异性,30,肿瘤细胞的迁移和浸润（侵袭）,肿瘤转移过程中的细胞迁移过程,迁移的途径： 淋巴道 血道 种植性转移 转移的发生与否，常被视作癌症患者病程的严重程度以及治疗效果的指标 肿瘤转移则是癌症患者死亡的最主要原因,31,与现有方法的对比,Conventional Transwell Assay,RTCA Migration/Invasion Assay,大大简化实验步骤 实时定量检测细胞迁移/浸润,传统方法的缺陷： 操作繁琐实验的影响因素增多导致实验的重复性不好 人工计数结果受主观因素影响大结果不客观 检测时间点少无法描述迁移的完整变化可能月遗漏重要实验结果,RTCA实现肿瘤细胞迁移浸润实时高效率检测,检测流程,33,RTCA研究小分子的细胞迁移抑制作用,34,此例可以对比transwell与我们CIM plate的价格区别，如上图，做这个药物的抑制迁移的IC50，我们的CIM板，一块16个孔就能完成，800元。然而，transwell考察3个时间点，每个药物剂量做3复孔，按照每孔40元，共需要2880元,MicroRNA-200c repress migration and invasion of breast cancer cells by targeting actin-regulatory proteins FHOD1 and PPM1F,Mol Cell Biol. 2012 Feb;32:633-51,结合microRNA及siRNA调控的细胞迁移检测,RTCA实时检测 microRNA作用下的细胞迁移,35,Douglas Hanahan and Robert Weinberg, Cell 144, 646-674,肿瘤微环境,肿瘤细胞通过自分泌和旁分泌，改变和维持自身生存和发展的条件，促进肿瘤的生长和发展 全身和局部组织亦可通过代谢、分泌、免疫、结构和功能的改变，限制和影响肿瘤的发生和发展 对于认识肿瘤的发生、发展、转移等有着重要的意义，而且对于肿瘤的诊断、防治和预后亦有着重要的作用,36,共培养系统是一个平台，它的应用领域很灵活，可以随意开展实验 只要是想研究两种细胞相互影响，就可以用我们的共培养系统 需要指出的是- 我们的上室（insert)是独立的，适用于目前我们在销售的任何一款板子，无论是E-plate L8，16，96.,38,应用专辑一案例,信号通路,RTCA在内源性GPCR信号通路研究中的应用,G-偶联蛋白受体（GPCRs），即 7-跨膜蛋白，是当今临床与科研药物的单一治疗靶点，也是迄今为止发现的最大的靶点家族。据推测，人类基因组中该家族的功能成员超过300个，涉及到多种不同细胞与组织间的广泛信号途径。研究证实，GPCR功能的研究，有助于免疫学、神经病学、心脏病学与肿瘤学领域多种疾病的治疗。,RTCA技术 VS 传统GPCR测定方法,RTCA技术只需将细胞接种于含有微金电极的培养板上，即可对GPCR激活导致的细胞骨架结构的微小变化与细胞收缩情况进行准确测定。,客户提出的问题,1：你们与钙流方法的差异 钙流是测定的离子通道，是亚细胞水平测定方法，不能给出细胞水平的变化，然而细胞水平才真正具有生理学意义。我们的产品指示的是细胞水平的变化。 2：你们的产品是否有现成的应用 我们的用户已经开展了很多GPCR的研究，有一定的技术积累，我们可以为客户提供经验及技术的帮助。,应用实例二,肿瘤免疫-细胞免疫,45,肿瘤免疫（tumorImmunology）是研究肿瘤的抗原性、机体的免疫功能与肿瘤发生、发展的相互关系,机体对肿瘤的免疫应答及其抗肿瘤免疫的机制、肿瘤的免疫诊断和免疫防治的科学。肿瘤免疫治疗肿瘤免疫学治疗的方法种类繁多，已发展成为继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗模式肿瘤生物学治疗方法。,在细胞免疫方面： T淋巴细胞 K细胞（抗体依赖性细胞毒细胞）介导ADCC NK细胞（自然杀伤细胞）及其介导