化验技术协会第七期培训资料2.doc

*化验技术协会第七期培训资料（药物分析工）*高效液相色谱法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。 1对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。 (1)色谱柱 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等)也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。 填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在l5nm(1nml0)以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。 以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH28的流动相。当pH大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。 (2)检测器 最常用的检测器为紫外检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检测器(DAD)，荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关，示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应，蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液的浓度通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应至少符合紫外可见分光光度法项下对溶剂的要求，采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。（3)波动相 由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷健合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定牌号的填充剂方能满足分离要求者，可在该品种项下注明。2系统适用性试验色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验，应符合要求。如达不到要求，可对色谱分离条件作适当的调整。(1)色谱柱的理论板数（n） 在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR(以分钟或长度计，下同，但应取相同单位)和半高峰宽(Wh/2)，按n5.54(tRWh2)2计算色谱柱的理论板数。(2)分离度(R) 无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。分离度的计算公式为：2（tR2-tR1）R=W1+W2式中：tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1及W2为此相邻两峰的峰宽。除另有规定外，定量分析时分离度应大于1.5。(3)重复性 取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80、100和120的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0。(4)拖尾因子(T) 为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为：W0.05hT=2d1式中：W0.05h为5峰高处的峰宽；d1为峰顶点至峰前沿之间的距离除另有规定外，峰高法定量时T应在0.951.05之间。峰面积法测定时，T值偏离过大，也会影响小峰的检测和定量的准确度。3测定法（1）内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子： As/Cs校正因子()=： AR/CR式中：As为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；Cs为内标物质的浓度；CR为对照品的浓度。再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分(或其杂质)和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量； AX含量(Cx)= As/Cs式中Ax为供试品(或其杂质)峰面积或峰高；Cx为供试品(或其杂质)的浓度；As为内标物质的峰面积或峰高；Cs为内标物质的浓度；为校正因子。当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液，使用等量同一浓度的内标物质溶液时，CsCs，则配制内标物质溶液不必精密称(量)取。(2)外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积(或峰高)，按下式计算含量： AX含量(cx)=cR AR式中各符号意义同上。由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量环或自动进样器进样为好。（3)加校正因子的主成分自身对照法 测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称(量)取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述(1)法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度(以噪音水平可接受为限)或进样量(以柱子不过载为限)，使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的1025或其峰面积能准确积分通常含量低于0.5的杂质，峰面积的相对标准偏差(RSD)应小于10；含量在0.5一2的杂质，峰面积的RSD应小于5；含量大于2的杂质，峰面积的RSD应小于2。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。(4)不加校正因子的主成分自身对照法当没有杂质对照品时，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述(3)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图I，再记录等体积纯溶剂的色谱图。色谱图I上杂质峰的总面积(包括溶剂峰)，减去色谱图上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。(5)面积归一化法由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。方法是测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积及其之和占总峰面积的百分率。中国药品检验标准操作规范 高效液相色谱法是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基键合硅胶(又称ODS)，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长的紫外可见光检测器，其他的检测器有二极管阵列紫外可见光检测器、荧光检测器、电化学检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、质谱检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。洗脱分等度洗脱和梯度洗脱二种。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀实现程序控制。 现将检测器分述如下： 1.1 紫外检测器(Ultraviolet detector，UV) 紫外检测器是液相色谱中使用最广泛的检测器，几乎所有的液相色谱仪都配此类检测器，是一种选择性检测器。 工作原理：朗伯比尔(LambertBeer)定律，即当一束单色光透过样品池时，若流动相不吸收光，则吸光度(A)与吸光组分的浓度(C)和样品池的光径长度(L)成正比。 分类：紫外检测器包括固定波长检测器，可变波长检测器和光电二极管阵列检测器三类。 固定波长检测器的波长一般为254nm，以低压汞灯为光源，光源单色性好、光强度大、灵敏度高，适合于大多数芳香族、芳杂环、稠芳环类以及芳香氨基酸、核酸等的检测。 可变波长检测器是目前配置最多的检测器。光路系统类似分光光度计，一般采用氘灯或卤钨灯为光源，光束经单色器分光后按需要选择组分的最大吸收波长为检测波长，从而提高灵敏度。有的还具有双波长比例检测功能，可用于峰纯度检查。二极管阵列检测器(Diode array detector，DAD)是20世纪80年代出现的一种光学多通道检测器。在晶体硅上紧密排列一系列光电二极管，每一个二极管相当于一个单色器的出口狭缝，二极管越多分辨率越高，一般是一个二极管对应接受光谱上一个纳米谱带宽的单色光。DAD的工作原理是：复色光通过样品池被组分选择性吸收后再进入单色器，照射在二极管阵列装置上，使每个纳米波长的光强度转变为相应的电信号强度，即获得组分的吸收光谱，从而获得特定组分的结构信息，有助于未知组分或复杂组分的结构确定。许多色谱工作站可将两张图谱绘在一张三维坐标图上而获得三维光谱-色谱图，也可进行峰纯度检查。 以峰纯度数值说明某个色谱峰的纯度，数值越高，色谱峰为单峰的可能性越大，数值越低，色谱峰为重叠峰的可能性越大，用于指导色谱分离条件的摸索。随着化学计量学的发展，将色谱信息和相对应的光谱信息相结合，按一定的数学模型处理，能解决重叠峰的识别和定量难题。但DAD检测器的灵敏度比通常的UV检测器约低一个数量级。所以单纯用于含量测定或杂质检查时，还是采用UV检测器好。优点：灵敏度高、噪音低、线性范围宽、对流速和温度的波动不灵敏，适用于梯度洗脱及制备色谱。 缺点：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的选择有一定限制，流动相的截止波长必须小于检测波长。 适用范围：大多数有紫外吸收的化合物。 1.2 荧光检测器(Fluorophotometri detector，FD) 工作原理：具有某种特殊结构的化合物受到紫外光激发后能发射出比激发光源波长更长的光，称为荧光。荧光强度(F)与激发光强度(I0)及荧光物质浓度(C)成正比。 优点：灵敏度高、选择性好，是微量组分和体内药物分析常用的检测器之一。 缺点：只适用于能够产生荧光的物质的检测，适用范围不如紫外检测器。影响因素较多，对溶剂的纯度、pH值、样品浓度、检测温度等需很好地控制。 适用范围：具有天然荧光的物质可以直接检测，也可通过荧光衍生化使原本没有荧光的物质转变成荧光衍生物后测定，从而扩大了荧光检测器的适用范围。主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶等的检测。 1.3 电化学检测器(Electrochemical detector，ECD) 电化学检测器是测量物质的电信号变化，对具有氧化还原性质的化合物，如含硝基、氨基等有机化合物及无机阴、阳离子等物质可采用电化学检测器。包括极谱、库仑、安培和电导检测器等。前三种统称为伏安检测器，用于具有氧化还原性质的化合物的检测，电导检测器主要用于离子检测。其中安培检测器(amperometric detector，AD)应用较广泛，更以脉冲式安培检测器最为常用。 工作原理：在两电极之间施加一恒定电位，当电活性组分经过电极表面时发生氧化还原反应(电极反应)，电量(Q)的大小符合法拉第定律QnFN。因此，反应的电流(I)为：InFdNdt，式中n为每摩尔物质在氧化还原过程中转移的电子数，F为法拉第常数，N为物质的摩尔数，t为时间。当流动相的流速一定时，dNdt与组分在流动相中的浓度有关。 优点：灵敏度很高，尤其适用于痕量组分分析。 缺点：干扰比较多，如生物样品或流动相中的杂质、流动相中溶解的氧气及温度的变化等都会对其产生较大的影响。电极寿命有限，对温度和流速的变化比较敏感。 适用范围：应用范围广，凡具氧化还原活性的物质都能进行检测，本身没有氧化还原活性的物质经过衍生化后也能进行检测。 1.4 蒸发光散射检测器(Evaporative light scattering detector，ELSD) 是20世纪80年代出现的通用性质量型检测器。不论化合物是否存在紫外、荧光或电负性基团，原则上均可用ELSD检测。 工作原理：将色谱洗脱液引入雾化器与通入的气体(常为高纯氮，有时是空气)混合形成均匀的微小液滴，经过加热的漂移管蒸发除去流动相而样品组分形成气溶胶，然后进入检测室，用强光或激光照射气溶胶产生光散射，用光电二极管检测散射光。散射光的强度(I)与组分的质量(m)通常具有下述关系：IKmb或lgIblgm+lgK，式中K和b为与漂移管温度、雾化气体压力及流动相性质等实验条件有关的常数。因此，散射光的对数响应值与组分质量的对数呈线性关系。为得到重复性较好的测定结果，必须注意雾化器中的气流和漂移管中温度的稳定。 优点：通用型检测器，对各种物质有几乎相同的响应。 缺点:灵敏度相对较低，流动相必须是挥发性的，不能用非挥发性的缓冲盐及表面活性剂。 适用范围:适用于挥发性低于流动相的组分，主要用于糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯、皂苷及甾体等等无紫外吸收或紫外末端吸收的化合物的检测。 1.5 示差折光检测器(Differential refractive index detector，RID)工作原理；利用组分与流动相的折光率的不同，其响应信号(R)与组分的浓度(Ci成正比：R=ZCi(ni-n0)，式中Z为仪器常数，ni为i组分的折光率，n0为流动相的折光率。优点：通用型检测器，只要组分的折光率与流动相的折光率有足够的差别就能检测。缺点：灵敏度低、受环境温度、流量及流动相组成等波动的影响大，一般不能用于梯度洗脱。适用范围：RID为通用型检测器，适用于无紫外吸收化合物的分析，如糖类分析。1.6 质谱检测器(MassSpectrum Detector，MSD)与液相色谱仪联用的质谱检测器是将色谱系统流出的组分经过液质联用接口在一定条件下离子化(如电喷雾电离(Electronspray Ionization，ESI)后，进入质量数分析器(如四极杆质谱、离子阱质谱、二级或多级串联质谱等)，按照离子的质荷比大小分离，记录响应信号并列成谱图。一般地，采用全离子扫描模式可得到特定组分的质谱图，从而得到组分的化学结构信息;采用选择离子监测(SIM)模式可得到特定质量数碎片离子的色谱图，可用于定量测定。优点：灵敏度高，选择性好，能同时给出组分的结构信息。缺点：响应信号受离子化效率限制，仪器较为昂贵，通常需专人使用与维护。适用范围：组分的结构鉴别，微量及痕量组分的分析，药物代谢分析等。2 高效液相色谱仪的使用要求2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定进行定期检定，应符合规定。2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。3 操作前的准备3.1 流动相的制备 用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求，水应为新鲜制备的高纯水，可用超级纯水器制得或用重蒸馏水。凡规定pH值的流动相，应使用精密pH计进行调节。配制好的流动相应通过适宜的0.45m滤膜滤过，用前脱气。应配制足量的流动相备用。3.2 供试溶液的配制 供试品用规定溶剂配制成供试品溶液。定量测定时，对照品溶液和供试品溶液均应分别配制2份。供试品溶液在注入色谱仪前，一般应经适宜的0.45m滤膜滤过。必要时，在配制供试品溶液前，样品需经预净化，以免对色谱系统产生污染或影响色谱分离。3.3 检查上次使用记录和仪器状态 检查色谱柱是否适用于本次实验，色谱柱进出口位是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的pH值与该色谱柱是否相适用，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置 4 操作 4.1 泵的操作 4.1.1 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。 4.1.2 打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml，设置高流速(如9mlmin)或用冲洗键PURGE进行充泵排气，观察出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止(STOP)冲洗，关闭排放阀。 4.1.3 将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏。初始平衡时间一般约需30分钟。如为梯度洗脱，应在程序器上设置梯度状态，用初始比例的流动相对色谱柱进行平衡。 4.2 紫外可见光检测器和色谱数据处理机的操作 4.2.1 开启检测器电源开关，选择光源(氘灯或钨灯)，选定检测波长，待稳定后，测试参比和样品光路的信号应符合要求，设置吸光度方式和检测响应时间(一般不大于1s)，设置满刻度吸收值(适用于记录仪)。 4.2.2 开启色谱处理机，设定处理方法，初步设定衰减、纸速、记录时间、最小峰面积等参数，或设定记录仪的纸速和衰减。 4.2.3 进行检测器回零操作，检查处理机的电平(LEVEL)，应符合要求，或检查记录仪的笔应处在设定的起始位置，如有变动，可继续回零操作直至符合要求。 4.2.4 记录基线，待色谱系统充分稳定后，进行处理机斜率测试，符合要求后方能进行操作。 4.3 进样操作 4.3.1 六通阀式进样器 4.3.1.1 把进样器手柄放在载样位置(LOAD)。 4.3.1.2 用供试溶液清洗配套的注射器，再抽取适量，如用定量环(LOOP)载样，则注射器抽取量应不少于定量环容积的5倍，用微量注射器定容进样时，进样量不得多于环容积的50，在排除气泡后方能向进样器中注入供试品溶液。 4.3.1.3 把注射器的平头针直插至进样器的底部，注入供试品溶液，除另有规定外，注射器不应取下。 4.3.1.4 把手柄转至注样位置(1NJECT)，定量环内供试溶液即被流动相带入流路。 4.3.2 自动进样器 在程序控制器或微机控制下，可自动进行取样、进样、清洗等一系列动作，有几种比较典型的自动进样装置：圆盘式自动进样器、链式自动进样器、坐标式自动进样器等，操作者只需将样品按顺序装入贮样室内即可。 4.3.2.1 将供试品溶液经适宜的0.45m滤膜滤过，取续滤液置进样小瓶中，盖上带有垫片的瓶盖，顺时针方向旋紧。为避免进样堵塞以及进样器损伤，一般应选择与自动进样器型号相配套的进样小瓶。 4.3.2.2 将进样小瓶依次放入贮样室内，记录瓶位置号(VIAL)。如果自动进样器有控温功能，根据实验要求和样品稳定性，设置适宜的温度。 4.3.2.3 检查自动进样器是否为默认位置，设定自动进样器参数，检查进样针冲洗系统是否正常，冲洗液是否足够，管路内是否有气泡等，检查流动相是否有足够的量能完成整个程序进样。 4.3.2.4 设定供试品溶液的自动进样的起始位置、终止位置、进样体积、稀释倍数、数据文件名等，用START开始进样。 4.4 色谱数据的收集和处理 4.4.1 注样的同时启动数据处理机，开始采集和处理色谱信息，如系记录仪，则注样同时按一下记号键作起始记号。 4.4.2 最后一峰出完后，应继续走一段基线，确认再无组分流出，方能结束记录。 4.4.3 根据第一张预试的色谱图，适当调整衰减、纸速、记录时间等参数，使色谱峰信号在色谱图上有一定强度。定量测定中，一般峰顶不得超过记录满量程。再按(4.3.14.4.1)进行正式分析操作。如果要用处理机进行运算，还可按第一张图的色谱参数，参照说明书，对参与运算的色谱峰进行鉴别操作，然后进行正式分析操作。 4.4.4 含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2次，由全部注样结果(n4)求得平均值，相对标准偏差(RSD)一般应不大于1.5。 4.4.5 色谱系统适用性试验应符合中国药典的要求，如按指定峰计算的理论板数(n)和拖尾因子(T)以及相邻峰之间的分离度(R)。计算公式为： tR tR n=16()2或n=5.54()2 W Wh/2 式中：tR为保留时间，W和Wh/2分别为峰宽和半高峰宽，取相同单位。 W0.05 T= 2d1式中：W0.05为离基线5%峰高处的峰宽，d1为峰上升边离5%峰高处的距离。 2（tR2- tR1） R= W1+W2 式中：tR1和tR2分别为相邻前后二峰的保留时间，W1 和W2分别为其峰的底宽，t和W取相同单位。 为保证色谱系统的适用性，所规定的有些色谱条件可在一定范围内调节，由于各色谱条件对分离结果有累积效应，故同时调节多个条件应予避免。 4.5 测定结果处理 4.5.1 内标法 用含对照品和内标物质的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式计算出校正因子(f) As/Cs校正因子（）= AR/CR 式中 As和AR分别为内标物质和对照品的峰面积或峰高；Cs为加入内标物质的浓度；CR为加入对照品的浓度。再根据含内标物质的供试品溶液色谱峰响应值，计算含量（Cx）: AX含量(Cx)= As/Cs 式中：Ax和As分别为供试品（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高；Cx为供试品（或其杂质）的浓度；Cs为加入内标物质的浓度。必要时，再根据稀释倍数、取样量和标示量折算成为标示量的百分含量，或根据稀释倍数和取样量折算成百分含量。 4.5.2 外标法 按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积(或峰高)，按下式计算含量： Ax含量(Cx)=CR AR式中各符合意义同上。 4.5.3 峰面积归一化法按药品标准有关项下进行峰面积归一化法求组分含量的，按下式计算： Ai百分含量（C%）=100% A式中: Ai为被测含量组分峰面积，A为参与计算的全部峰面积(溶剂峰和其他干扰峰除外)之和。 采用本法时，应考虑：(1)最小组分和最大组分的检测响应是否在线性范围内；（2）在所用检测波长下各组分响应的差别。 4.5.4杂质检查法 按药品标准规定的方法测定杂质的含量或限量时，如杂质对照品已经建立，则可按规定用上述外标法进行测定；如杂质对照品没有建立，无法获得，或杂质未知，则可按下法测定。当供试品溶液的溶剂干扰供试品溶液的测定时，应取等体积溶剂进样，并将溶剂的背景色谱响应，从供试品溶液的色谱响应中扣除。4.5.4.1 加校正因子的主成分自身对照法 在已知杂质在规定检测波长下的响应因子与主成分不一致的情况下，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称(量)取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按内标法以主成分为内标计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种正文中，用于校正杂质的实测峰面积，再按照规定的方法计算杂质的含量。由于没有杂质对照品，应规定这类杂质峰的位置，如用相对于主成分的相对保留时间表示，还应进行方法耐用性考察，如采用3根以上不同品牌的色谱柱同法测定各杂质的相对保留时间，RSD应小于5.0。 4.5.4.2 不加校正因子的主成分自身对照法 在杂质未知或未建立杂质对照品时，可采用不加校正因子的主成分自身对照法测定杂质的含量或限量。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度(以噪音水平可接受为限)或进样量(以柱子不过载为限)，使对照溶液中的主成分色谱峰高约达满量程的1025或其峰面积能准确积分(通常，含量低于0.5的杂质，峰面积的RSD应小于10；含量在0.52的杂质，峰面积的RSD应小于5；含量大于2