〖医学〗基因表达的调控-原核生物的基因调控.ppt

基因的表达与调控 原核生物的基因调控,一、绪论,原核生物和单细胞真核生物直接暴露在变幻莫测的环境中,食物供应毫无保障,只有能根据环境条件的改变合成各种不同的蛋白质,使代谢过程适应环境的变化,才能维持自身的生存和繁衍。,假如在大肠杆菌内,平均一个基因1000bp,一个细胞中约有2500-3000个基因。正常情况下,可带有107个蛋白质,平均每个基因产生3000多个蛋白质分子。 但实验却表明,每细胞中有些蛋白质少之10个分子,而有一些却多达500000个分子。,一个大肠杆菌中只有15个分子的半乳糖苷酶,若将细胞培养在只含乳糖的培养基中,每细胞中酶量可高达几万个分子,其合成的速度和总量随环境的变化而改变。 表明基因的表达受到调控。,细菌在进行调控时: 一个体系在需要时被打开,不需要时被关闭。这种“开-关”(on-off)活性是通过调节转录来建立的,也就是说mRNA的合成是可以被调节的。,1、基因表达及基因表达调控 是指生物体基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录及翻译等一系列过程,合成特定的蛋白质,进而发挥其特定生物学功能的全过程,称为基因表达(gene expression)。 对这个过程的调节就称为基因表达调控(gene regulation或gene control)。,基因表达调控主要表现在以下几个方面: 转录水平上的调控(transcriptional regulation); mRNA加工成熟水平上的调控(differential processing of RNA transcript); 翻译水平上的调控(differential translation of mRNA)。,2、基因表达调控的基本原理 多级调控:主要是转录水平的调控 四个基本的调控点: 基因的结构活化 转录起始:最有效的调节环节 转录后加工及转运 翻译及翻译后加工,3、基因表达的调控方式 负调控(negative transcription regulation): 调控蛋白+DNA序列 基因表达(相应蛋白质降低) 正调控(positive transcription regulation): 调控蛋白+DNA序列 基因表达 (相应蛋白质增加),负调控,根据作用特征,负控诱导,负控阻遏,正调控,根据作用特征,正控诱导,正控阻遏,正调控与负调控并非互相排斥的两种机制,而是生物体适应环境的需要,有的系统既有正调控又有负调控; 原核生物以负调控为主,真核生物以正调控为主; 降解代谢途径中既有正调控又有负调控;合成代谢途径中一般以负调控来控制产物自身的合成。,主要环节在转录,起始因子决定RNA聚合酶识别特异性。,操纵子(operon): 原核生物中几个功能相关的结构基因成簇串联排列组成的一个基因表达的协同单位(DNA序列)。 一个操纵子 编码序列(2-6)+启动序列+操纵序列+(其他调节序列),二、原核基因调节特点,1、乳糖操纵子的发现: 葡萄糖充分时: 葡萄糖代谢有关的酶基因-表达 其他糖代谢有关的酶基因-关闭 葡萄糖耗尽时,乳糖存在: 乳糖代谢有关的酶基因 -表达 葡萄糖代谢有关的酶基因-关闭 说明酶可以诱导,一)乳糖操纵子(lactose operon),乳糖的利用及其相关的酶: 乳糖 (在通透酶作用下进入细菌) 别位乳糖 葡萄糖+半乳糖,半乳糖苷酶,乳糖的利用,半乳糖苷酶,乳糖确实可诱导Lac mRNA的合成,能以乳糖作为唯一碳源和能源生长的定为lac+;相反,称之为lac-。,安慰诱导物(gratuitous inducer),诱导物的加入和去除对lac mRNA的影响,2、结构基因顺序 乳糖操纵子包括三个结构基因:Z、Y、A,P,Y,Z,A,O,转录方向,A 模型的提出,1940年,Monod发现细菌“二次生长曲线”; 1950年,Monod和Tacob发现两对基因Z和I; Szilard发现I基因决定阻遏物的合成; Jocob提出结构基因旁边还有开关基因,即操纵基因。,J.Lederberg 1948 不同Lac-突变型 细菌结合转移和转导试验 证明三基因紧密连锁,B 实验验证 结构基因,Lac Z-Y+A+:- 半乳糖苷酶基因突变,Z编码-半乳糖苷酶;Y编码-半乳糖苷透过酶;A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶。 -半乳糖苷酶是一种-半乳糖苷键的专一性酶,除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外,还能水解其他-半乳糖苷(如苯基半乳糖苷)。 -半乳糖苷透过酶的作用是使外界的-半乳糖苷(如乳糖)能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。 -半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转到-半乳糖苷上,形成乙酰半乳糖。,在这些突变体中,有一类突变体,它体内的半乳糖苷酶的形成不依赖于诱导物的存在,即没有乳糖或别的半乳糖苷存在时也能合成- 半乳糖苷酶,这种突变体称为组成型突变。分为两类:I型和O型。 I型:野生型为I+,突变型为I-; O型:野生型为O+,突变型为Oc。,调节基因,I+I-或O+ Oc后,Z、Y、A结构基因均表现为永久表达,所以I基因被称为调节基因(regulatory gene)。 I基因是一个产生阻遏物的调节基因,其产物使体系关闭。I-突变体由于不能产生阻遏物,使细胞成为lac永久表达型。I-/I+局部二倍体由于带有一个正常阻遏物,使细胞中的lac仍然被抑制。, I 型组成型突变,Hfr lac I+Z+strST6S,F- lac I-Z-strrT6r,培养无诱导物,混合培养,1小时后加入抗生素 杀死供体菌,- 半乳糖苷酶活性逐渐上升,2小时后 加诱导物,组成型变为诱导型,说明: I+合成特异的阻遏物,无诱导物时可阻止Z基 因表达 诱导物可作为阻遏物的拮抗物,使阻遏物失活, Z基因表达 I-不产生无活性阻遏物,因而无需诱导物,Z基 因就可表达,阻遏物起负调控作用,I基因产物及其功能,1967年 W.Gilbert 和B.Miller Hill将 lac I+ 或lac I- E.coli细胞提取物分别与放 射性标记的IPTG混合,发现lac I+ E.coli细胞 提取物中有某种蛋白质可以与IPTG结合,且每 个蛋白分子可以与4个IPTG分子结合,而lac I- E.coli细胞提取物中没有这种蛋白质与IPTG结 合,说明与IPTG结合的蛋白是I基因的产物。,lac I+ 的离体反应液(35S标记的I基因的产物)与不同的DNA分子相互作用,发现I基因的产物 不与失去lac操纵子全部基因的DNA分子结合 在有IPTG时不与lac操纵子基因结合 不与lacOC突变体的DNA分子结合 说明 I基因的产物有两个结合位点,阻遏蛋白: N端: 159aa头部片段:为HTH,与操纵基因DNA的大沟结合; 核心区:有6个折叠,诱导物就结合在两个核心区之间的裂缝中; C端: 为两组亮氨酸拉链,形成四聚体。,活性阻遏蛋白的另一个重要特点是形成四聚体 等位基因间的互补(interallelic complementation),不同等位基因编码的亚基可相互缔合形成杂合多聚体, 其性质不同于任何一种纯合多聚体。,Uninducible lacI S mutations are dominant,Constitutive lacI d mutations are dominant,组成型 表达,不可 诱导,Lac阻遏物 结构特点 调控机制 (负调控),由基因I编码生成的蛋白质 具有四级结构的蛋白质 具有4个相同亚基,每个亚基中都有一 与诱导剂和O基因结合的位点 Lac阻遏物与O基因结合: 结构基因关闭 Lac阻遏物与诱导剂结合: 不与O基因结合,结构基因开放 RNA聚合酶结合,转录开始, Lac阻遏物,I,O,O,诱导剂,乳糖操纵子的负调控,O+Z+ - OcZ+ OcZ+/O+Z+ OcZ/OZ+ OcZ+/OZ ,基 因 型,组成表达,诱导表达,操纵基因 O基因组成型突变,说明: Oc对O+显性,但只对其临近的基因才有作 用,称为顺式显性。,顺式显性(cis-dominant):显性效应只对处于同一染色体上它所调控的结构基因才起作用的现象,遗传学图谱分析指出,Oc突变位于I与Z之间,所以,lac体系的4个基因的序列为IOZY。通过这些观察,Jacob和Monod推断Oc突变代表DNA链上的一个位点或一个非编码区域,而不是一个基因,因为可编码的基因具有互补性,而Oc没有这一特性。 O决定相邻Z基因的产物是诱导型合成还是组成型合成,O区域称为操纵基因。,操纵基因的结构,特点:-7-+28,以+11为对称轴 典型特征具有反向重复序列 相互作用位点可以缩小在+5-+17,I,P,O,Z,Y,A,调控基因 控制位点 结构基因,DNA,阻遏蛋白,启动序列,cAMP-CAP结合位点,操纵序列,半乳糖苷酶,通透酶,乙酰基转移酶,3、乳糖操纵子(lactose opron) 结构,RNA聚合酶 结合位点,(6759),(728),General organization of the lac operon of wild-type E. coli. Order of controlling elements and genes: lacI: promoter-lacI-terminator operon: promoter-operator-lacZ-lacY-lacA-terminator,-54 -58 -65 -69,-47 -8,-3 +21,AUG:+39 +41,-47 -84,1)P-O区 Promotor: -84-+ 1 Operator: -7-+28 两者有7bp重叠,使这段序列可能无法同时结合RNA聚合酶和阻遏蛋白,也可能虽然可以同时结合,但无法形成开放的转录起始复合物,2)Lac阻遏物的作用-负调控,没有乳糖存在时,Lac阻遏物的作用-负调控,有乳糖存在时,3)诱导物的作用机制 a诱导模式 平衡模型(间接作用):DNA结合的阻遏蛋白和游离的阻遏蛋白迅速平衡,加入诱导物后,诱导物结合到游离的阻遏蛋白上,打破了平衡,从而导致结合的阻遏蛋白释放,阻遏蛋白从操纵基因上解离下来的速率非常低以至不能和平衡模型相吻合。,b 解离模型(直接作用):诱导物直接和结合在操纵基因上的阻遏蛋白相互作用。可能通过改变其构象使其离开操纵基因。,4)两个矛盾,第一个诱导物如何进入细胞? 第一个-半乳糖苷酶如何产生? 解释: 本底水平表达,在非诱导状态下有少量(1-5个mRNA分子)lac mRNA合成。由于阻遏物的结合并不是绝对紧密,即使在与操纵基因紧密结合时,也会偶尔掉下来,这时启动子的阻碍被解除,RNA聚合酶开始转录,导致在非诱导情况下少量透过酶可以合成。 mRNA的这种合成称为本底水平表达。,5)CAP-cAMP复合物在乳糖操纵子表达中 的作用-乳糖操纵子的正调控,1965年, Sutherland 发现大肠杆菌培养液中葡萄糖的含量总是与cAMP含量成反比。 1968年,发现大肠杆菌培养液中加入cAMP可增加半乳糖苷酶的产量。,葡萄糖消耗完,Adenylate cyclase converts ATP into cAMP. Phosphodiesterase converts cAMP to AMP. Glucose catabolite may inhibit adenylate cyclase and stimulate Phosphodiesterase, cAMP的作用: 刺激多种可诱导的操纵子。 cAMP和CRP结合后发挥作用。 CRP(分解物基因激活物蛋白):由Crp基因编码,有二个相同亚基的蛋白质。其中一个与DNA结合的domain, 一个与cAMP结合的domain。 CRP和cAMP结合后,称为CAP,刺激操纵子,导致结构基因转录(正调控)。,CAP (catabolite activator protein)以两种方法来激活转录: (1)它可能直接和RNA Pol相互作用; (2) 作用于DNA,改变其结构,从而帮 助RNA Pol结合。,葡萄糖 cAMP Lac操纵子被抑制,无葡萄糖,cAMP浓度高时,有葡萄糖,cAMP浓度低时,cAMP-CAP与DNA相结合,造成双螺旋弯曲,形成一个“环状”结构, lacI+基因产物(阻遏物)无法与O区相结合,易于形成三元转录起始复合物,只要有这个“环”的亚基存在,lac operon就可以得到表达。 cAMP-CAP还能直接影响RNA聚合酶的活性。,6)乳糖操纵子基因表达的一般情况,基因表达的外界信号 基因表达的负调控 基因表达的正调控 正、负调控协同表达,葡萄糖、乳糖浓度的变化 Lac阻遏物与操纵基因 cAMP+CAP与相应的DNA序列,条件2:,低乳糖,条件3:,低乳糖,条件4: 高葡萄糖 低cAMP 高乳糖,Lac 阻遏蛋白封闭转录时, CAP对该系统不发挥作用,条件1: 低葡萄糖 高cAMP 高乳糖,Lac 阻遏蛋白不封闭转录时, 没有CAP存在,也无高效转录活性。,Lac 阻遏蛋白不封闭转录, CAP+ cAMP 加强转录。,O,O,O,O,O,当阻遏蛋白封闭转录时,CAP对该系统不能发挥作用; 如无CAP加强转录,即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合,操纵子仍无转录活性。 若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时,细菌首先利用葡萄糖。葡萄糖对 lac 操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic repression)。 lac操纵子的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖。,无乳糖时,有乳糖时,无葡萄糖 cAMP浓度高,有葡萄糖cAMP浓度低,lac操纵子基因表达既需要乳糖又需缺乏葡萄糖,色氨酸操纵子(tryptophane operon)负责色氨酸的生物合成,当培养基中有足够的色氨酸时,这个操纵子自动关闭,缺乏色氨酸时操纵子被打开,trp基因表达,色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程(而不是诱导过程)中起作用。由于trp体系参与生物合成而不是降解,它不受葡萄糖或cAMP-CAP的调控。,二)色氨酸操纵子,色氨酸的合成分5步完成。每个环节需要一种酶,编码这5种酶的基因紧密连锁在一起,被转录在一条多顺反子mRNA上,分别以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表,编码邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。,1. 色氨酸操纵子的结构, trpR(89)和trpABCDE(25)不紧密连锁; 操纵基因在启动子内 有衰减子(attenuator) 启动子和结构基因不直接相连, 二者被前导顺序(Leader)所隔开,trpE基因是第一个被翻译的基因,与其相邻的是前导区trpL和衰减子trpa。trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR,该基因距trp基因簇很远,后者在大肠杆菌染色体图上25min处,而前者则位于90min处。 在位于65min处还有一个trpS(色氨酸tRNA合成酶),它和携带有trp的tRNATrp也参与trp操纵子的调控作用。,2.阻遏物对色氨酸操纵子的负调控-阻遏系统,trpR基因在其自身的启动子作用下,合成分子量47000的调控蛋白,但没有与O结合的活性,因此被称为辅阻遏蛋白(aporepressor),除非培养基中有色氨酸。 辅阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物,与操纵区结合并使之关闭转录trp mRNA。,有Trp,无Trp,mRNA,O,P,trpR,调节区,结构基因,RNA聚合酶,RNA聚合酶,色氨酸操纵子,3.衰减作用对色氨酸操纵子的调控,前导区的序列特点 转录衰减机制 衰减机制的实验证据,前导区(Leader):结构基因起始密码子前有162个碱基,其中的 139个碱基构成前导区。 前导肽(Leader peptide):推测前导区mRNA可编码14个氨基酸 组成的多肽,其中第10和第11位均为色氨酸。 有四个富含GC的区段,相邻的区段之间可形成茎环结构。,弱化子( attenuator ): 一段位于结构基因上游前导区,具有终止子结构的短序列,通过前导序列转录产生的 mRNA 形成类 似于终止子的二级结构,达到转录终止的目的。,前导序列,第10、11密码子为trp密码子,14aa前导肽编码区:,包含序列1,形成发夹结构能力强弱: 序列1/2序列2/3序列3/4,UUUU 3,前导肽,前导mRNA,A.当色氨酸浓度高时,1)转录衰减机制,衰减子结构 就是终止子 可使转录,RNA聚合酶,终止,前导肽,前导mRNA,RNA聚合酶,B.当色氨酸浓度低时,Trp合成酶系相关 结构基因被转录,序列3、4不能形成衰减子结构,Low Trp,High Trp,高Trp时: Trp-tRNATrp 存在 核糖体通过片段1(2个Trp密码子) 封闭片段2 片段3,4形成发夹结构 类似于不依赖因子的转录终止序列 RNA聚合酶停止转录,产生衰减子转录产物,转录、翻译偶联,产生前导肽,低Trp时: Trp-tRNATrp 没有供应 核糖体翻译停止在片段1 (2个Trp密码子) 片段2,3 形成发夹结构 转录不终止 RNA聚合酶继续转录,2)衰减机制的实验证据,a 衰减作用的发现 trp 操纵子受阻遏蛋白阻遏时,表达仅下降为阻遏 前的1/70,而Lac 操纵子受阻遏蛋白阻遏时,表达 下降为阻遏前的1/1000 trpS5突变株 温度敏感型突变株,它所编码的Trp-tRNAtrp合成酶 只在30时有活性,42时无酶活性。比较野生型和 突变型在42和30时Asase的酶活性,表明Trp- tRNAtrp有调节功能 trpLD102突变株 该细菌在有色氨酸的培养基中仍有很高的色氨酸合 成酶活性,trpED53中L不缺失(弱化子存在),trpLD102中L缺失(弱化子不存在),缺失前导区后的表达比有前导区的表达要高得多,充分说明trp操纵子的表达调控除阻遏作用外,还受到前导区的影响,失去了这个因素就失去了一个调控机制。,b 衰减作用的遗传学证据 trpL29突变株 增强终止突变型 前导区29位核苷酸GA,使AUGAUA trpL75突变株 增强终止突变型 前导区75位核苷酸GA,减弱了2区和3区形成茎环能力 trpL29 trpL131GC双突变株 trpL29 trpLC1419双突变株 解除终止,Trp的存在对终止转录是有效的,弱化子仅允许约10的RNA聚合酶通过。 缺乏Trp时,弱化子允许所有的聚合酶通过。,3)其他氨基酸饥饿对Trp衰减子的影响, 当所有的氨基酸都不足时,核糖体翻译移动的速度就更慢, 结果有利于1+2和 3+4发夹结构的形成,于是RNA pol停止 转录。 大多数其他氨基酸的缺乏, 核糖体停止运转的位置可让1区和2区配对,并不影响3区和4 区形成终止子结构,所以trp基因不表达 当Gly饥饿时, 1区和2区中可形成部分双链结构,不影响3区和4区 当Thr饥饿时, 影响1区/2区和2区/3区配对。但不影响3区和4区配对 当Arg饥饿时, 影响1区/2区配对,但不影响2区/3区配对, 3区和4区不配对,4)协调,阻遏作用:粗调开关 阻遏物的作用是当有大量外源色氨酸存在时,阻止非必需的先导mRNA的合成,它使这个合成系统更加经济。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少。 弱化作用:细调开关 弱化作用的信号是Trp-tRNAtrp的多少,通过控制前导肽的翻译来控制转录的进行,依靠弱化作用,色氨酸的存在就使色氨酸操纵子的转录被抑制了10倍。与色氨酸阻抑物的作用 (70倍)合在一起,这就意味着色氨酸水平对色氨酸操纵子的表达施加了700倍的调节效果。,有实验证明,在不加色氨酸的培养基中,trp mRNA的合成仍然受到部分阻遏,现在一般认为,野生型细胞中同时存在着有活性和无活性的阻遏物,培养基中色氨酸浓度的变化,能够使这两种阻遏物间的平衡发生倾斜,最终做出关闭或启动trp操纵子的决定,从而维持一定的色氨酸含量。,5)原核生物衰减作用的普遍性,三)半乳糖操纵子(galactose operon),包括3个结构基因: 异构酶(UDP-galactose-4epimerase,galE), 半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactose transferase, galT), 半乳糖激酶(galactose kinase, galK)。 这3个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。GalR(调节基因)与galE、T、K及操纵区O等离得很远,而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同。,A gal操纵子的特点: 它有两个启动子,其mRNA可从两个不同的起始点开始转录; 它有两个O区,一个在P区上游-67-53,另一个在结构基因galE内部。,两个相距仅5bp的启动子,可以分别起始mRNA的合成。每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2。 从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时,才能顺利进行,RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CAP和较高浓度的cAMP。从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖,高水平的cAMP-CAP能抑制由这个启动子起始的转录。当有cAMP-CAP时,转录从S1开始,当无cAMP-CAP时,转录从S2开始。,B 双启动子的功能 半乳糖不仅可以碳源供细胞生长,而且尿苷二磷酸半乳糖(UDPgal)是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下,UDP-gal是通过半乳糖差向异构酶(galE )的作用由UDP-葡萄糖合成的。生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。,葡萄糖存在时 cAMP缺少 S1不能启动 S2启动转录,半乳糖存在时 cAMP浓度升高 S1启动转录 S2启动受抑制,结果:在两种不同的环境里都可以形成细胞壁物质的前体,阿拉伯糖(arabinose) 是可作为碳源的五碳糖。 参与阿拉伯糖代谢酶的基因分布于不同操纵子中,但由一个调节基因(araC)的产物调控。,四)阿拉伯糖操纵子( arabinose operon),1、基因组成 结构基因:araA、araB和araD 分别编码L阿拉伯糖异构酶、核酮糖激酶和L核酮糖5磷酸4差向异构酶。 调节基因:araC 操纵基因:O1、O2 基因E、F:负责转运阿拉伯糖进入细胞,araC基因位于另一个操纵子中,它编码的araC蛋白是操纵子的调控因子。,araBAD和araC基因的转录是分别在两条链上以相反的方向进行的。,AraC的结构: AraC由292aa残基组成,其N端结构域(1-170aa) 可结合阿拉伯糖并参与形成二聚体,C端(178-292aa) 为DNA结合结构域。AraC对araBAD的调控包括正、负调控两种方式。 araBAD上有三个AraC结合位点:araO1(-106-144)、araO2(-265-294和位于araBAD启动子的araI位点。araI位点为两个“半位点”(-56-78和-35-51)。araO1 在araBAD表达调控中的作用较小。,2、调节机制,调节蛋白AraC的作用 第一,它调节它自己的生物合成。 当AraC水平较低时,其基因从Pc开始表达。当AraC蛋白浓度高时,由于AraC与AraO1结合,而araO1与AraC基因的启动子重叠,可阻遏araC基因的表达。,第二,它对araBAD既是负的调节子也是正的调节子(regulator),它既能结合于araO2又能结合于araI。通过两种异构体实现:Pr(阻遏作用);Pi(诱导作用)。 负调控 当cAMP水平较低且缺乏阿拉伯糖时,AraC二聚体结合在araO2和araI1半位点使DNA成环,阻遏araBAD的表达。,正调控 当Ara存在而无葡萄糖时,Ara与AraC蛋白结合使其构象改变而释放araO2,此时AraC结合在araI1和araI2处。同时由于cAMP的积累激活CRP,活化的CRP结合在位于araO1和araI间的CRP位点。 araC+Ara和CRP共同作用可激活RNA pol转录araBAD。因此,AraC具有正、负调控的双重作用。 由于Ara+araC结合在araO1处使araC不能表达。,但当同时有葡萄糖和Ara时,由于cAMP不能激活CRP,araBAD则不表达,同时araC也不表达。,3、小结 AraC蛋白是双功能的,单纯的C蛋白结合于araO1(-100-144),起到阻遏的作用;当C蛋白和诱导物Ara结合形成的复合体时是Cind蛋白(ind是induction的缩写),即诱导型的C蛋白,它结合于araI区(-40-78)使RNA 聚合酶结合于PBAD位点(+140),转录B、A、D三个基因; C蛋白结合araO1时也反馈性地阻遏了其本身的表达; C蛋白的两种状态(Cind和Crep)功能不同,结合的位点也不同。Cind结合于araI;Crep可结合于araO1和araO2; ara操纵子的C蛋白还可以调节分散的基因araE和F,因此此转录单位也称调节子(regulon); 本操纵子有两个启动子Pc和PBAD,可以双向转录; Pc启动子和araO1重叠。,五) DNA重排对基因表达的调节,鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimrium) : 鞭毛蛋白亚基的合成由2个非等位基因控制而出现两相性(diphasic)。 鞭毛抗原有两种(H1和H2),单个细菌只有一种鞭毛抗原,但同一菌落既可以表现为H1型,也可以表现为H2型。 在细菌的分裂中有1/1000的概率会出现由一相转变为另一相,称为相转变(phase variation) 。, H1和H2是由两个非等位基因编码,位于不同的染色体座位。 H2基因与抑制H1转录的阻遏物基因(rhl)紧密连锁 H2基因的上游有995bp的片断(两侧为反向重复序列,右反向重复序列上游16bp处含有H2基因的启动子,中间含有倒位蛋白基因)可以倒位,一旦发生倒位,则H2和rh1无法转录,Phase 1,在沙门氏菌鞭毛合成中,通过改变启动子的方向来实现调节: 2相:H2与rhl基因同时表达,且阻止H1基因的表达; 1相:H2与rhl基因都不表达,H1基因进行表达。,六) RNA聚合酶转录起始对基因表达的调控,1、因子的替换-级联调控,早期, 从一套基因的转录到另一套基因的表达是噬菌体感染的共同特点。 通过噬菌体编码的RNAPol的合成来完成。,正常营养生长期中,枯草杆菌因子为43或A (分子量为43KD),与大肠杆菌的RNA聚合酶相似,2。,因子更换用于噬菌体基因表达时序的控制 早期基因转录:2 43(宿主),gp28基因表达 中期基因转录:2 gp28,gp33和gp34基因表达 晚期基因转录:2 gp33gp34,因子更换意义 亚基更换后只识别新的一类基因 导致RNA聚合酶活性改变,几乎大部分的因子转换都发生在孢子形成中。 孢子的形成涉及到生物合成活性的剧烈变化,这些变化和很多基因有关。 营养时期的基因被关闭,孢子形成的特异基因表达。,2 43 SpoOA(转录调节物),F表达,中隔形成前,2 43 H,E 表达,前孢子中: 2 F: 第一套孢子形成基因表达(G,信号蛋白) 2 G: 转录孢子形成晚期基因,母细胞中: 2 E: 母细胞中基因表达(K) 2 K: 母细胞中晚期基因表达,孢子形成是由两种级联调控控制的,在级联调控中每一间隔部分的都相继被激活,每个因子指导一套特殊的基因合成蛋白质。 当一种新的因子被激活,原来的因子被取代,这样通过转移因子来打开基因或关闭基因。,2、修饰核心酶替换亚基,T4噬菌体的时序调节依赖本身携带的蛋白对宿主的核心酶加以修饰,改变其和亚基的结合能力,乘机将本身编码的蛋白取代原来的亚基,从而改变RNA聚合酶的识别能力。, T4噬菌体在生活周期的不同阶段合成不同的mRNA。 早期转录mRNA:编码有关DNA合成、RNA的转录调控、重组等的酶 晚期转录mRNA:编码噬菌体结构蛋白及与粒子装配和裂解宿主等有关的基因。 内部蛋白:T4的头部含有几种小分子蛋白,可伴随着 DNA一道注入到细菌中. ADP-核糖转移酶(ADPRT)(内部蛋白):将ADP-核糖(ADPR)连接到宿主RNA聚合酶的亚基上的精氨酸胍基上使其被修饰,内部蛋白伴随着DNA一道注入到细菌中,包括ADPRT; 利用宿主的RNA聚合酶转录第一批早期mRNA; ADP-核糖转移酶(ADPRT)将ADP-核糖(ADPR)连接到 宿主RNA聚合酶的亚基上的精氨酸胍基上使其被修饰 ,降低了RNA核心酶与因子的结合能力,而增加了其 与T4噬菌体编码的蛋白Mot的亲和力, Mot蛋白取代了亚基,使新的RNA聚合酶不再识别寄主 的基因和T4早期基因的启动子,而能识别下一批基因的 启动子。 到转录晚期同时,RNA聚合酶被进一步地修饰,其两个 亚基各结合了一个ADPR分子及4个修饰性蛋白,称其 为超修饰(hupermodified)的RNA聚合酶。,基本步骤,3、 RNA聚合酶的代换,T7噬菌体根据自身的感染特点而采用RNA聚合酶的代换方式来进行时序调控。 T7是E.coli的烈性噬菌体,基因组长为39,936nt,可能具有55个基因,其中44个基因的产物已鉴别.,早期转录:在感染后的前6分钟,使用了宿主E.coli的RNA聚合酶,转录的基因主要有10个。0.3基因编码宿主限制酶的抑制蛋白,使T7进入宿主免遭降解;0.7基因编码一种蛋白激酶,能将E.coli的RNA聚合酶磷酸化,为抑制宿主RNA Pol作准备;基因1编码T7 RNA Pol聚合酶,它所识别的启动子是由23bp组成的保守顺序(-1716)。,晚期转录分为二组(和) 感染后612分钟后T7就利用自己的RNA聚合酶转录第组基因。 其中基因2的产物是E.coli聚合酶抑制剂,最终废除了宿主RNA聚合酶的功能,而将自己编码的RNA聚合酶取而代之。 感染12分钟后表达 组基因。此转录物约含15个基因,它们主要编码头部蛋白,尾部蛋白以及负责装配,这样使得T7噬菌体不至于过早地装配成粒子。,七) 翻译调控,1、翻译起始的调控 SD序列与AUG的距离:4-10为佳,9最佳 mRNA二级结构对翻译起始的调控,A 基因,A 基因,cp 基因,lys 基因,Rep 基因,Rep 基因,cp 基因,A转录一个顺反子需要二级结构的改变,而这种二级结构的改变依赖于前一个顺反子的翻译,B 翻译阻遏对起始的调控,Q噬菌体的复制酶可结合于SD顺序 阻断核糖体在mRNA上的移动,抑制了翻译,C 重叠基因对翻译起始的调控,D 核糖体蛋白是自身合成的转录抑制子,大肠杆菌的核糖体中含有50多种蛋白,各种核糖体蛋白在体内的量是平衡的,它们与rRNA组装成核糖体。 核糖体蛋白的基因组合成数个操纵子,每一个操纵子都包含多至11个核糖体蛋白基因(某些与其合成与生长速度耦联的非核糖体蛋白也包括在这些操纵子中,包括RNA聚合酶的亚基、)。 与其他操纵子一样,这些操纵子在转录水平受到调控。,在核糖体组装时,与rRNA结合的蛋白为关键蛋白,它对核糖体蛋白的合成起调控作用。 每一个操纵子编码自己的关键蛋白,它抑制整个操纵子的表达。,某种r蛋白合成过快时,r蛋白可与其模板mRNA上的SD序列结合,而使其不能与核糖体结合,导致mRNA的降解而使这种r蛋白合成速度降低。,与关键蛋白结合的rRNA和关键蛋白的mRNA有相似性。当核糖体蛋白的mRNA表达过量时,关键蛋白较多地与核糖体蛋白的mRNA结合,导致其不能与rRNA结合形成核糖体。这样就可调控核糖体蛋白的合成。,E 核糖体开关(Riboswitch) 调节性的RNA 成分,它们通过直接探测到小分子代谢物,控制基因转录和翻译而起作用。 有些核糖核酸开关对转录终止起作用,有些则在翻译水平上来控制形成的RNA结构,阻碍核糖体与mRNA 的结合.,蛋白或与蛋白紧密相关的代谢物,与mRNA上的riboswitch结合并改变riboswitch的空间结构,阻止核糖体继续读取编码蛋白的mRNA片段。 比如,当焦磷酸硫胺素(TPP)与大肠杆菌thiM riboswitch结合后,核糖体识别的mRNA片段(TPP的阅读起点)被掩盖起来。,F 反义RNA( antisenseRNA)的调控,反义RNA( antisenseRNA): 能与mRNA互补结合,从而阻断mRNA翻译的RNA分子 反义基因: 转录产生反义RNA的基因 可调控原核细胞中基因表达、控制噬菌体溶菌-溶源状态以及抑制转座子的转位作用等。 在真核细胞中也存在反义RNA,但功能尚不全部明了。,反义RNA的作用机制 反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和(或)编码区,引起翻译的直接抑制或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNase的敏感性增加,使其降解。 反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合,从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后阻止了核糖体的结合。,反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。 反义RNA和mRNA有不完全的互补序列,可以形成双链的RNA杂交体。而在mRNA上紧随杂交区之后的是一段U丰富区。其结构类似于终止子结构,从而使转录开始不久后即终止。,E.coli中有两种外膜蛋白(OmpC和OmpF)和OmpB基因座(OmpR和envZ)与渗透压应答有关 高渗透压时OmpC产量增加,OmpF产量受到控制; 低渗透压时omF产量增加, OmpC产量受到控制序列分析发现OmpC基因上游存在另一个转录单位,转录形成的RNA可与OmpFmRNA翻译起始区部分互补,干扰mRNA作用的互补RNA (mic-RNA, mRNA-interfering complementary RNA ),ompF基因有ompR产物的高亲和位点 ompC基因有ompR产物的低亲和位点 低渗透压时,ompR基因产物少,只结合高亲和位点,ompF基因表达量升高;高渗透压时,ompR基因产物多,可结合低亲和位点,与ompC基因结合,双向转录,促使ompC基因表达量升高外,反向转录生成micFRNA可与ompF的mRNA结合,阻碍翻译。,2、翻译延长的调控 A 稀有密码子:在基因中利用频率很低的密码子 细胞可通过翻译,调控不同蛋白含量的高低。即使对于同一操纵子上不同的基因,其产物在数量上也可大不相同。,许多调控蛋白在细胞内含量很低,编码这些蛋白的基因中高频率地使用了很多稀有密码子,稀有密码子对应低丰度的tRNA,因此,翻译速度受tRNA供应的限制,影响了蛋白质合成的总量。 而其它基因中利用这些稀有密码子频率很低。,B 二级结构对翻译延伸的调控,红霉素能与核糖体大亚基的23S rRNA结合,抑制翻译。 抗红霉素基因编码的甲基化酶是使23s rRNA上的腺苷酸甲基化, 使红霉素无法与其结合,从而达到抗红霉素的作用。 抗红霉素基因的mRNA的前导顺序中有4段RNA顺序,可以相互配对形成二级结构。编码甲基化酶区域的S-D顺序正好处在3-4区之间,细菌在葡萄糖缺乏时可产生报警物质cAMP。可保证其利用其它糖类,如lac操纵子、gal (半乳糖)操纵子和ara(阿拉伯唐)操纵子等。 培养基中营养缺乏,蛋白质合成停止,RNA合成也趋于停止,这种现象称为严紧控制。,3、翻译的终止调控,严紧控制(strigent control) 或严紧反应(strigent response) 当细菌处于极差的生存条件下,培养基中缺乏足够的氨基 酸,蛋白质合成受到抑制,并关闭大量的代谢过程。是细 菌为渡过困难时期而存活下来的适应性表现。 rRNA和tRNA的合成大幅度下降,某些mRNA的合成也下降具有这种特性的细菌的基因型为rel+ 松驰控制( relaxed control) 把培养基中营养缺乏,蛋白质合成停止后,但RNA合成速率 并不下降。具有这种特性的细菌的基因型为rel-(松驰型突 变体)(relaxed mutants),研究发现,在氨基酸缺乏时,rel+菌株能大量合成两种特殊的核苷酸鸟苷四磷酸(鸟苷5一二磷酸-3二磷酸,ppGpp)和鸟苷五磷酸(鸟苷5一三磷酸-3二磷酸,pppGpp),其电泳的迁移率和一般的核酸不同,而rel-菌则不能。,GTP+ATPpppGpp+AMPppGpp,魔斑,魔斑,严紧因子(RelA):是一种(p)ppGpp的合成酶,它可以催化ATP将焦磷酸加到另一个GTP或GDP的3位点。提纯的RelA酶它本身实际是没有活性的,而在核糖体存在时它才有活性(L11蛋白)。,细菌缺乏氨基酸时会产生鸟苷四磷酸(ppGpp,魔斑)和鸟苷五磷酸(pppGpp)作为报警物质。 细菌缺乏任何一种氨基酸时,会在核糖体的A位点结合无负载的tRNA,消耗了GTP而无法形成肽键,导致GTP不断消耗而产生报警物质。 GTP +ATP pppGpp+ AMP ppGpp,任何一种氨基酸的缺乏或使任何氨基酰-tRNA合成酶的失活突变都足以起始严紧反应,此表明严紧反应的触发器是位于核糖体A位点中的空载tRNA。 在正常条件下仅有氨基酸-tRNA在EE-Tu的作用下位于A位点。但当氨基酸-tRNA对一个特殊的密码子不能作出有效反应时,空载tRNA便能得以进入,就阻断了核糖体的进程,而触发了一个空转反应(idiling reaction),空载tRNA到达A位,L11蛋白或某些其他成分构象的改变激活RelA酶,(p)ppGpp合成。,50S亚基的rplK基因编码,ppGpp的主要作用可能是影响rRNARNA pol与启动子结合的专一性,从而成为细胞内严紧控制的关键。 ppGpp也可抑制核糖体和其他大分子的合成,活化某些氨基酸操纵子的转录表达,抑制与氨基酸运转无关的转运系统,活化蛋白水解酶等。 ppGpp缩短大部分模板的转录延伸阶段。,ppGpp对rRNA转录的抑制,ppGpp使大部分模板的转录效率下降,4、mRNA稳定性对翻译的调控,在E.coli中降解mRNA外切酶有两种:RNaseII和多核苷酸磷酸 化酶(35), mRNA的二级结构可以阻遏酶的作用。 malE和malF同在一个操纵子中,且紧密连锁,但malE的产物比 malF 的产物的含量高20-40倍。 在malE 5端有2个IR存在,可以形成茎环保护其不被外切酶降解,IR,周质结合蛋白:膜蛋白20/40:1,总结,基因表达调控、操纵子、弱化子、正调控、负调控、诱导、阻遏 乳糖操纵子的正调控及负调控? 色氨酸的负调控及弱化作用? 其他水平的调控模式有哪些? 翻译调控的机理?,现今医学分为传统医学、基于“生物-医学模式”近代发展起来的西医，20世纪西医又发展到“社会-心理-生物医学”或综合医学模式，后基因组时代系统生物学的兴起，形成了系统医学在全球的迅速发展，成为继传统医学、西医学之后中、西医学汇通的未来医学。当代中国医学类专业比较优秀的学校有北京大学、华中科技大学、郑州大学等学校。 中医即中国传统医药学，是 现今医学分为传统医学、基于“生物-医学模式”近代发展起来的西医，20世纪西医又发展到“社会-心理-生物医学” （高血压心脏病糖尿病）或综合医学模式，后基因组时代系统生物学的兴起，（传染病丙肝乙肝甲肝）形成了系统医学在全球的迅速发展，成为继传统医学、西医学之后中、西医学汇通的未来医学。当代中国医学类专业比较优秀的学校有北京大学、（肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌） 华中科技大学、郑州大学等学校。 （肺血液血小板红血球白血球） 中医即中国传统医药学，是形成于数千年前的中国，是建立在人们与疾病长期斗争的经验总结及阴阳五行、八纲脏腑辨证基础上，运用朴素辩证法及思辨推理方法，认识机体、自然、疾病三者关系，发展起来的（传染病丙肝乙肝甲肝）一门以“功能人”包括功能脏器为概念的独特的医学哲学理论体系。（肺炎青霉素肝炎） 在治疗上，除了药物外，还有针灸、推拿气功、（高血压心脏病糖尿病）耳针等特殊疗法，它是世界传统医学中最完善的一种医学理论体系。它为人类尤其为中国人民（肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌） 健康和民族繁衍做出了巨大贡献。 （肺血液血小板红血球白血球） 西医学是最近三四百年来建立在解剖学、生物学及现代科学技术基础上、发展起来的一门以“解剖人、肉体人”为概念的、新兴的现代医学科学理论体系。主要采用科学实验方法，从宏观到微观，直至目前的分子基因层次水平，发展极为迅速，超过其它任何一门医学科学，成为世界医学史上的主流。 可见中西医学，一个是以“功能人”为概念的独特的哲学医学理论体系，一个是以“解剖人、肉体人”为概念的新兴的现代医学科学理论体系，二者都不是以完整人为研究对象的科学，从理论讲二者都不是科学的，势必影响各自发展。事实也证明这一切，（高血压心脏病糖尿病）中医长期停滞不前、（高血压心脏病糖尿病）疗效也不确实。西医尽管发展到目前的基因分子层次，但疾病发病率居高不下，对绝大部分疾病发病原因认识不清、发病机理弄不明白，治疗受到制约，在小小SARS、禽流感面前竟束手无策，在糖尿病、癌症、心脑血管疾病、尿毒症等相当多疾病面前更是不得不求助或借助中医治疗。一个是疗效不确实，一个是有些甚至相当多疾病无法治疗，这就是中西医学结合的缘由。然而，由于二者是两套理论、两股道上跑的车（肺血液血小板红血球白血球），风马牛不相及，从理论上讲就没有结合的可能，只是形式上的融合罢了。（肺炎青霉素肝炎） 故出现西医对治疗不了的疾病只好求助中医，而中医则往往采用西医诊断中医治疗，以及中西治疗法一块用的局面。 （高血压心脏病糖尿病）至于（传染病丙肝乙肝甲肝）循证医学、比较医学、后现代医学、行为医学等所谓“医学”，都称不上一门独立的医学科学，关于这一点在灵魂医学有关章节中将有相关点评。 总之，目前以中西医学为主的世界各种医学科学都存在不完整性的瑕疵，即都是以不完整的人为研究对象的医学科学，故不能解决目前存在于中西医学甚至人文社会科学史上一切疑难模糊问题，成为阻碍医学科学前进的羁绊。的确，要解决目前存在于中西医学甚至人文社会科学上一切疑难模糊问题，显然已