海洋药物.ppt

海洋药物,一、 概 述 一、海洋知多少？,数据：海洋占地球表面的71，生物量占地球总生物量的87，生物种类达20多万种，利用率仅为1。 海洋环境具有高盐、高压、低温、缺氧等异于陆地环境的特点，在此特殊的生长环境中，海洋生物在长期的进化过程中也随之形成了与陆地生物不同的代谢途径和机体防御机制，产生了一些结构独特而药理毒理作用显著的活性物质。,海洋环境的特殊性和物种的多样性构成了海洋天然活性产物的多样性，如大环内酯类、聚醚类、萜类、肽类、苷类、生物碱类和多糖类等物质。生物活性：抗真菌，抗病毒，止血，抗凝血，抗肿瘤等活性。,1、海洋药物的含义与内容,海洋药物指以海洋生物和海洋微生物为药源，运用现代科学方法和技术研制而成的药物。 现有的海洋药物大多属于天然药物范畴，即直接从海洋生物中提取的有效成分，也有一些是海洋生物活性成分经过人工合成或生物技术转化而获得。,2、海洋药物分类,中药：海洋中药是在中医药理论指导下，将海洋药用生物按我国新药审批要求研制成的中药。大多情况下，海洋药用生物按其性味和功效，多与其他中药材配伍成复方中药； 化学药：采用化学的方法，从海洋生物中提取、分离、纯化得到的生物活性成分作为药物先导化合物，然后经合成或半合成方法研制而成的海洋药物； 生物制品：采用基因工程、蛋白质工程、细胞工程和发酵工程等生物技术从海洋生物和微生物中获得的海洋药物，在分类上属于生物制品类药物。,海洋生物的特点 生活环境与陆生生物迥然不同：有一定的水压、高盐度、小温差、有限的溶解氧、有限的光照及化学缓冲海水体系； 次生代谢产物较陆生生物独特新颖：新陈代谢、生存繁殖方式、适应机制具有显著特性； 化合物结构独特、生物活性多样； 开展海洋药物研究具有重要的理论意义与实际应用价值。,3、海洋药物研究的重点领域,海洋抗癌药物研究(主导方向) 海洋心脑血管药物研究 海洋抗菌、抗病毒药物研究 海洋生物毒素 其他海洋药物研究,4、海洋药物的研究进展,国外概况 1964 年日本学者研究河豚毒素 (tetrodotoxin, TTX) 为开端 1968 年美国NIC对海洋生物资源的抗癌活性筛选使海洋药物的研究成为一个独立的领域。 NIC每年研究、检测的上万个天然产物中，1/4 来自海洋生物。,头孢菌素钠 (cephalosporin natrium) 为海洋微生物中发现并开发成功的第一个“海洋新抗”，开创了开发海洋新抗生药的先例。 海绵中获得海绵尿嘧啶核苷 (spongouridine)，后研究成功合成方法，获得有效抗癌药物阿糖胞苷 (arabinoside cytosine, Ara-C)，目前在市场上获得广泛应用。,80 年代后期，科学技术的进步，尤其是现代生物工程技术，使海洋药物的广泛开发成为可能。对海洋药物的研究与开发获得不少具有突破性的成果，已从海葵、海绵、腔肠动物、被囊动物、棘皮动物和微生物体内分离得到具有抗菌、抗病毒、止血、镇痛、抗炎、抗肿瘤和心血管等生物活性的多种新型化合物。 如从海蛤提取的蛤素 (mercenene) 有很好的抗癌作用；存在于海鞘中的膜海鞘素 (didemnin) 为强的抗肿瘤、免疫抑制剂； 鲸鲨软骨中提取的 6-硫酸软骨素(chondroitin sulfate A)具有降血脂、抗动脉硬化的作用。 从黄海葵提取的新型强心药物海葵毒 (anthoplearin) A 和 B等。,1994年联合国海洋法公约正式生效，许多沿海国家都把开发利用海洋作为基本国策。 美、日、英、法、俄等国分别推出包括开发海洋药物在内的“海洋生物技术计划”、“海洋蓝宝石计划”、“海洋生物开发计划”等，投入巨资发展海洋药物及其他海洋生物技术。 由于现代分离分析技术的发展与应用，使复杂的海洋生物微量活性成分得以快速地分离和鉴定。 新的基因工程、细胞工程和酶工程等生物技术的研究与应用，进一步促进了海洋药物的研究与开发。 海洋药物这一新生领域已成为世界关注的热点。,国内概况 我国是世界上最早应用海洋药物的国家。 写成于公元一世纪的神农本草经中收载海洋药物约为10种。 到1596年李时珍所写的本草纲目中海洋药物90余种。 至1765年，本草纲目拾遗中海洋药物总数发展到100余种。 目前，可作药用的海洋生物达1 000余种。,我国现代海洋药物的发展是在1978年全国科学大会上提出“向海洋要药” 、“开发海洋湖沼资源，创建中国蓝色药业”的战略设想之后，结束了缓慢发展的历史，进入高速发展的新时期的。 相继成立了中科院海洋所、植物所，及农业部黄海所，青岛海洋大学，中山大学，北京大学等一批海洋生物研究及药物开发基地。 随着生物工程技术和分子生物学的飞速发展，也给我国的海洋生物研究注入了新的活力。 我国同世界先进水平的差距正逐步缩短。,二、海洋生物活性物质,海洋中存在大量的生物活性物质，大多数都是前所未见的、或与已知化合物的组成结构差异很大的天然产物，由此可见海洋中蕴藏着极其丰富的天然产物，是人类寻找新药的最大源泉。 海洋生物活性天然产物的特异结构和药理作用是陆源生物所无法比拟的，其中多数具有显著的药理活性和强效性，毒副作用相对较小，一些活性物质经研究已证明在防治癌症、艾滋病、心脑血管病、老年病等疑难病症具有独特效应，已成为开发新药特药的主要方向之一 。,1、多糖类,海洋生物中常见的多糖：琼脂、卡拉胶、海带多糖等 生物活性：抗凝血、降血脂、止血、抗病毒、抗肿瘤等活性。 例如：从红藻中提取的多糖硫酸盐具有抑制爱滋病病毒复制。 从棘皮动物中提取的粘多糖具有抗凝血、降血脂、抗病毒、抗肿瘤等活性。,2、聚醚类,聚醚类毒素是一类化学结构独特，毒性强烈并具有广泛药理作用的天然毒素。 聚醚类结构是海洋天然产物特有的一类化学结构，其毒理和药理作用均十分特殊，分别对神经系统、消化系统、心血管系统以及细胞膜发挥较高的选择作用。,主要代表性毒素有西加毒素、岩沙海葵毒素和刺尾鱼毒素等。这些毒素大多数由微藻产生。 从泥鳗中分离得到的西加毒素，西加毒素对交感神经有兴奋作用。岩沙海葵毒素(PTX)是目前最强的冠状动脉收缩剂之一，作用强度比血管紧张素强100倍。动物实验表现为升血压，伴心律失常，可导致心脏骤停。PTX对心脏的作用主要是由于它能增加细胞膜对Na+、K+、Ca2+的通透性，从而导致持续除极，心律失常和心肌挛缩。,如刺尾鱼毒素 maitotoxin, 是目前分离得到的结构最大的聚醚类化合物，被认为是毒性最大的非蛋白质类化合物。,3、大环内酯类,海洋生物中的大环内酯类物质主要来源于蓝藻、甲藻、海绵、苔藓虫、被囊动物和软体动物及某些海洋菌类，具有抗肿瘤、抗癌、抗病毒、抗菌等功能。,A,B,C,苔藓虫素（Bryostatins） 是海洋苔藓动物中分离得到的一系列大环内酯化合物，其中bryostatin-1对白血病细胞P388有显著抑制作用，剂量为 1070u gkg时，可使P388荷瘤小鼠的抑瘤率达 5296，经美国国立癌症研究所（NCI）临床前验证后，目前已进入临床试验。 Bryoslatin-4对淋巴细胞的ED50值为10-5ugml，也是正处于临床研究的药物。苔藓虫素19（Bryostatin19） 是从中国南海产的总合草苔虫分离得到的一种新型的大环内酯化合物，也具有很强的抗癌活性 。,4、多肽类,是海洋生物中另一大类生物活性物质。 组成海洋多肽化合物的氨基酸除常见的外，尚有大量特殊氨基酸，如软骨藻酸(domoic acid)海人酸(-kainic acid)等。 常见的海洋肽类化合物有直链肽、环肽等。 如海兔毒素10 (dolastatin 10),又如环肽kahalalide F对结核杆菌又极高的抑制活性。,5、不饱和脂肪酸,多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids，PUFAs）的研究与开发正成为一个新的热点，海洋生物中含有丰富的不饱和脂肪酸，共有31种。 PUFAs 系指含有两个或更多个双键的长链脂肪酸，因其独特的生物活性，已经进入生物制药和营养保健品领域。特别是含有三个或更多个非共轭双键的C1822PUFAs，因潜在的治疗学和营养学等方面的作用而引起研究者的极大兴趣。,二十碳五烯酸（EPA），和二十二碳六烯酸（DHA）等，具有很强的生理活性，是人及动物生长发育所必需的物质，能够抗血栓，防止血小板聚结，舒张血管，降低胆固醇和甘油三酯的综合作用，提高高密度脂蛋白含量，降低低密度脂蛋白含量，从而降低血液黏度，使血压下降。 高度不饱和脂肪酸可用于治疗心肌梗塞、冠心病、脉管炎、脑动脉硬化等多种疾病。同时，这些化合物也是很好的营养品。EPA和DHA被称为“脑黄金”， DHA可参与胎儿脑细胞分裂和脑细胞数的增殖，能促进脑细胞的生长发育，提高儿童智力。,三、几种重要的海洋药物,具有抗肿瘤作用的海洋药物 具有心血管系统药理作用的海洋药物 具有神经系统药理作用的海洋药物 具有抗病毒作用的海洋药物 具有抗菌作用的海洋药物 具有抗衰老作用的海洋新药,1、具有抗肿瘤作用的海洋药物,抗肿瘤作用的机制主要是：（1）干扰肿瘤细胞有丝分裂和微管聚合；（2）调节蛋白激酶C合成；（3）抑制蛋白质合成；（4）增强机体自身防御体系；（5）抑制肿瘤新生血管形成。 我国已在临床使用的抗肿瘤海洋生物药物主要有：鲨鱼油、角鲨烯、海力特、刺参多糖钾、海嘧啶 海王金牡蛎、6-硫酸软骨素、 “909”胶囊、长棘海星苷、脱溴海兔毒素等。国外已用于临床试验的抗肿瘤海洋生物药物主要有：Dolastatin10、Bryostatin1、DideminB、Discodermolide、Halomons、Ecteinascidin-743、HalichondrinB、Squalamine、Girodazole、Aeroplysinin等,国外正在研制的海洋抗肿瘤药物,苔藓虫素（Bryostatins） ：苔藓虫素是金属蛋白酶抑制剂，也是肿瘤血管生长抑制剂，具广谱抗肿瘤作用。 膜海鞘素（Didemnins） ：现已从海鞘中陆续分离的20余个环肽类化合物均显示出不同程度的抗肿瘤和抗病毒活性 ， Didemnin B 的抗癌活性表现最强，它既能抑制蛋白质的合成，也能抑制DNA、RNA的合成，床期实验。 海兔毒素（Dolastatins） ：从海洋软体动物海兔中首次分离发现的抗肿瘤活性成分，属环肽类化合物。 Dolastatin10已经完成化学全合成，并正在美国进行期临床试验，主要用于小细胞肺癌、卵巢癌、黑素瘤和前列腺癌等实体瘤的治疗。,海鞘素（Ecteinascidin-743）：从加勒比海海鞘Ecteinascidia turbinata分离出来的一种具有很强抗肿瘤作用的生物碱。ET-743是迄今为止已发现的海洋天然产物及其类似物中抗肿瘤活性最强的化合物。ET-743可使DNA烷基化而发挥肿瘤抑制作用。 Discodermolide ：其抗肿瘤机制与紫杉醇类似，但抗有丝分裂效应比紫杉醇大100倍 。,2、具有心血管系统药理作用的海洋药物,我国已有多种海洋抗心血管疾病药物投入临床或使用，如藻酸双酯钠（PSS）、血海灵、甘糖酯和D-聚甘酯、鱼肝油酸钠、海星胶代血浆、褐藻淀粉硫酸酯、褐藻酸钠、紫菜多糖、甘露醇烟酸酯、甲壳质及其衍生物、珍珠母注射液、鱼油多烯酯等药物。,3、具有神经系统药理作用的海洋药物,从海洋药用生物的河豚鱼、石房蛤中提取出的河豚鱼毒素、石房蛤毒素、西加毒素及其衍生物，具有麻醉作用，有可能研制成新型的全麻醉药或者局部麻醉药。 从牡蛎、珍珠、珍珠母、石决明、海螺壳、紫贝、海蜇等提取的海洋药用生物活性物质的特点是小剂量催眠、大剂量镇静，其对中枢神经系统具抑制作用，起镇静、催眠和抗惊厥作用，具有治疗焦虑、失眠和惊厥等症的功效。,海燕、海蛇等海洋生物具有解热镇痛作用，多数有抗炎、抗风湿作用，能使发热体温降至正常，有轻度或中度镇痛作用，对牙痛、头痛、神经痛、肌肉痛、关节痫等慢性钝痛有良好疗效；具抗炎消肿作用，能抑制急性炎症渗出过程。 河豚毒素（TTX）针剂曾代替吗啡、阿托品等治疗神经痛，它又显示了具有很强的局麻作用，可做为局麻药，比常用的麻醉药作用强万倍。,4、具有抗病毒作用的海洋药物,藻类是海洋中的初级生产者，承担着食物链的基础环节，海洋动物的许多活性物质都直接或间接地来源于藻类。海藻中提取分离并经分子修饰而得到的海洋硫酸多糖类化合物，前期研究表明可明显抑制HIV1对T细胞的急性感染，明显降低猴血浆中病毒滴度及RNA拷贝数，对血液中CD4细胞有一定的保护作用，同时升高血液中病毒抗体的含量。,四、海洋生物活性物质的制备技术,海洋生物体内的成分比较复杂，具有生物活性成分的含量通常比较少，有些成分的含量只有百万分之几，甚至更少。从海洋生物中提取、分离纯化出具有生物活性的天然产物是研究海洋生物活性物质的主要任务。 早期经典的提取、分离纯化方法有水蒸气蒸馏法，溶剂法，沉淀法和结晶法等，这些方法的特点是无需特殊的设备，操作比较简单。但是得到的往往是低分子量化合物和容易获得的简单成分或含量较高的成分。随着科学技术的发展，出现了许多先进的分离纯化方法，已开发出许多精密、准确和快速的分离纯化方法。,如果海洋生物所蕴含的许多活性成分是未知的，所以进行海洋生物活性物质的提取、分离的过程比较复杂，与陆地生物有些不同，在提取、分离有效活性成分的过程中，最好采用生物活性试验来追踪（如抗肿瘤筛选模型、抗菌筛选模型等），以确保其有效成分的部位所在，最后获得有效单一化合物 。 海洋天然产物可简单分为小分子化合物（分子量小于1000的各种天然产物）和大分子化合物（即多糖、蛋白质和核酸）。,1、小分子化合物的提取和分离纯化,提取（extraction）：或称抽提，是用溶剂（常称为浸取剂）使固体原料中的有效成分溶解并释放出来的过程。提取可分为有机溶剂提取和水提取。 提取的关键是选择合适的溶剂，已知的海洋天然小分子化合物中，大部分是亲脂性化合物，如聚醚类、大环内酯类、萜类、甾醇和不饱和脂肪酸类等均是极性较低、亲脂基团占优势的有效成分，因此，根据相似相溶原理，在提取此类海洋生物活性物质时，溶剂一般应选择极性较低、亲脂性较好的有机溶剂如石油醚、氯仿、乙醚和乙酸乙酯等。在提取亲水性和极性较强的化合物（如生物碱、苷类等）的过程中，经常选择水或醇的水溶液作浸取剂。,除了要考虑极性外，理想的有机溶剂还应具备下述条件：溶剂不能与天然产物发生化学反应，特别是不可逆反应；溶剂对目标活性物质溶解度大，对杂质溶解度尽可能小；有机溶剂要来源广泛、经济、安全、毒性小等。,小分子物质的分离纯化技术,萃取 层析技术,萃取,萃取（Extraction）是利用溶质在互相不能任意混溶的两相（如氯仿和水）之间分配系数的不同而使溶质得到分离的操作技术。 萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。 萃取操作中至少有一相为流体（液体或超临界流体），一般称该流体为萃取剂。 液-液萃取、超临界萃取和液-固萃取,超临界流体萃取,以超临界流体为萃取剂的萃取技术称为超临界流体萃取(SFE)。 超临界流体是指处于临界压力和临界温度以上状态的流体，此时物质既不是气体也不是液体的状态。临界温度是指该物质处于无论多么高的压力之下都不能被液化的最高温度，与之对应的压力称为临界压力，超临界流体操作过程中，含有目标产物的原料可以是液体，也可以是固体。,超临界流体萃取分离过程的原理是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。 在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，所以超临界流体萃取过程是由萃取和分离组合而成的。,无毒和不易燃性。CO2作为萃取剂，主要是它无毒、不易燃易爆，有较低的临界温度和临界压力，易于从混合物中分离出溶质。 有较低的临界温度和临界压力。CO2的临界温度为31.1，临界压力为7.3Mpa，CO2的临界条件比水更容易达到。,超临界流体最常用的萃取剂是CO2,超临界流体的传递性质。超临界流体的密度接近于液体的密度，而黏度却接近于气体，自扩散能力比液体大100 倍，与液体萃取相比，可以更快地完成传质，达到平衡，促进高效分离过程的实现。 超临界流体的溶解性。超临界流体的溶解度与密度有很大关系，在临界点附近，压力、温度的微小变化会引起流体密度的大幅度变化，从而影响其溶解能力。 超临界流体的萃取选择性。超临界流体应具有良好的选择性，根据相似相溶原理，如果超临界流体与萃取物质的化学性质越相似，溶解能力就越大。,SFE- CO2特别适用于热敏性、易挥发、易氧化成分的分离，可实现对海洋天然小分子化合物的纯化与精制。 例：二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），因具有防治心血管等疾病的显著功效而引起世界范围的研究开发热潮。但EPA、DHA为热敏性物质，且易发生氧化，获取高纯度的DHA、EPA制品是个难题。 SFE-CO2技术可望解决高纯度EPA、DHA制备的难题 ，特别是SFE技术和其它相关方法的联用，大大提高了EPA、DHA的分离纯度 。,层析技术,分离纯化海洋小分子化合物的常用层析技术： 大孔吸附树脂层析 吸附柱层析 分配柱层析 凝胶过滤层析 离子交换层析 高效液相层析,塔板理论-柱分离效能指标,色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H， 色谱柱的理论塔板数：n， 则三者的关系为： n = L / H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为：,大孔吸附树脂层析,大孔吸附树脂包含有许多具有微观小球的网状孔穴结构，颗粒的总表面积很大，具有一定的极性基团，使大孔树脂具有较大的吸附能力; 另一方面，这些网状孔穴的孔径有一定的范围，使得它们对通过孔径的化合物根据其分子量的不同而具有一定的选择性。通过吸附性和分子筛原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而达到分离的目的。,吸附柱层析,吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相，当混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的一种层析方法。 吸附层析的固定相常常有极性和非极性之分，前者如硅胶、氧化铝、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等，后者如活性炭等。,液-液分配层析,液-液分配柱层析往往简称为分配层析（色谱）。将两项溶剂中的一种涂在硅胶等多孔载体上，作为固定相，填充在色谱柱中，然后用与固定相液体不相溶的溶剂作为流动相进行洗脱，利用溶质在固定相和流动相两相溶液中分配系数的不同达到分离目的的一类层析技术。,正相色谱和反相色谱,分配色谱常用的基质有硅胶、硅藻土及纤维素粉等。 正相色谱用的固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如NH2和氰基团CN的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。,反向色谱：反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等,加压液相（柱）色谱 ：根据施加压力大小的不同，可以分为快速色谱（约2个大气压）、低压液相色谱（20个大气压）加压液相色谱用的载体多为颗粒直径较小（用于HPLC的直径甚至仅为5m）、机械强度及比表面积均大的薄壳型或全多孔硅胶微粒，并键合上不同极性的有机化合物，以适应不同类型分离工作的需要，因而柱效大大提高。,凝胶层析,凝胶的种类很多，分离纯化海洋天然小分子化合物常用的凝胶主要有葡聚糖凝胶以及羟丙基葡聚糖凝胶。 葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex系列，它是葡聚糖与3-氯-1，2环氧丙烷（交联剂）相互交联而成。Sephadex 的主要型号是G-10 - G-200，数字越大的，吸水率越大，排阻极限越大，分离范围也越大。 在Sephadex G-25和G-50加入羟丙基即可构成烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为Sephadex LH-20和LH-60。与Sephadex G系列仅具亲水性不同，LH-20和LH-60不仅保留了G-25和G-50原有的分子筛特性，可按分子大小分离物质外，也可以有机溶剂为流动相分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸、激素等。,离子交换层析,离子交换剂根据与基质的组成和性质两大类： 一类是疏水性离子交换剂，该类离子交换剂的基质是一种人工合成的、与水结合力较小的树脂，常用的一类树脂是苯乙烯和苯二乙烯的聚合物。树脂型离子交换树脂一般为网状结构的珠状体，其特点是机械强度大、流速快、与水的亲和力较小且容易引起蛋白的变性，故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。 另一类是以纤维素、交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖等为基质的亲水性离子交换剂，适合于分离蛋白质等大分子物质 。,2、多糖类物质的提取和分离纯化,多糖的理化性质 （1）分子结构 多糖在溶液状态下有着高级结构，代表活性状态。不同海洋生物提取的多糖，一级结构上有很大差异，采用酸解、色谱、质谱、红外光谱、核磁共振等手段，可以确定单糖的组成及取代基团。 （2）分子量 多糖的分子量相差很大，甚至不同提取方法，分子大小都不一样，这可能是因为加工过程造成多糖的降解。 （3）纯度 由于多糖的分子大小差异性，其纯度不同于一般化合物。其纯度只代表某一多糖在一定分子量范围内的均一组分。 （4）溶解性 难溶于冷水，在热水或碱液中可溶。不溶于丙酮、乙醇、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂。 （5）热稳定性 热不稳定，当温度大于40时，分解加快。 （6）酸碱稳定性 pH小于5时开始降解，小于3时有20%降解；大于7时氧化加快。 （7）化学性质 与硫酸-蒽酮、硫酸-苯酚反应阳性，常用于定量分析；可与部分有机、无机离子络合，如与十六烷基三溴化铵（CTAB）、氢氧化钡等结合沉淀。,多糖的常规分离纯化,将原材料进行粉碎等。另外，许多海洋生物如石莼、紫菜、海参、海洋真菌等的往往含有大量的表面脂肪，这些脂肪的存在可能会对多糖的提取产生影响，因此需要脱脂。通常的脱脂的方法是：将原材料加入到适量体积和浓度的乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液中，水浴加热或回流13小时，即可以达到脱脂的目的。 经预处理的原料大多数情况下用热水作溶剂来提取多糖，温度一般控制在90-100，反复提取23次。,杂质的去除,(1)除离子 （2） 除蛋白：从海洋动植物及微生物中提取的粗多糖往往含有大量的蛋白质，如螺旋藻中蛋白质含量高达藻体干重的60%以上，因此，多糖的提取与分离过程中，脱除蛋白质是非常重要的一个环节。脱蛋白的方法主要有：Sevag法 ；三氟三氯乙烷法 ；三氯乙酸法 ；酶法 ；,(3)除色素 ：海洋中的各种藻类，如蓝藻、绿藻、红藻、褐藻，之所以呈现各种颜色，是因为这些藻类种类中含有大量的色素。另外，在一些海洋动物和海洋微生物中也含有一定量的色素。因此，在从这些海洋生物中分离纯化多糖时往往需要除这些色素。,多糖的纯化方法,（1）分级沉淀法 常用的沉淀剂有甲醇、乙醇和丙酮等。多糖不易溶于乙醇，且随着聚合度的增大，在乙醇中的溶解度逐步降低。根据这一性质，在多糖的浓水溶液中分次加入乙醇，使乙醇的浓度渐增，5%、10%、15%、20%、90%、95%，分取各次析出的沉淀，在产量和浓度之间画出曲线，以此可以粗略地观察出多糖的组分。分级沉淀是按分子量的不同进行分离的，多糖分子量范围广，且有共沉淀现象，此法只能作粗略的分离用，需反复进行及综合使用别的方法才能达到精制多糖的目的。,（2）季铵盐沉淀法 阳离子清洁剂如十六烷基三甲铵盐（CTA盐）和十六烷基吡啶盐（CP盐）等与酸性多糖阴离子可以形成不溶于水的沉淀，使酸性多糖自水溶液中沉淀出来，中性多糖留存在母液中而分离。若再利用硼酸络合物，中性多糖亦可沉淀，或在高pH条件下，增加中性醇羟基的解离度而使之沉淀。因此将十六烷基铵溴化物（CTAB）顺次加入pH变化的多糖溶液中，即在酸性、中性、微碱性、强碱性的溶液中分步沉淀多糖。,（3）金属离子沉淀法 常用的络合剂有费林溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。 铜盐沉淀法：可选用的试剂主要有硫酸铜、氯化铜、醋酸铜、费林试剂等。基本方法是：在多糖的水溶液中加入铜盐试剂至沉淀完全，过滤或离心取沉淀并用水洗涤后，加5%的HCl（V/V）乙醇溶液分解铜复合物，可得多糖。 氢氧化钡沉淀法：饱和的氢氧化钡溶液可使树胶