实时定量PCR技术原理及应用.ppt

聚合酶链式反应技术及其应用,提 纲,第一节 聚合酶链式反应扩增原理 第二节 PCR反应体系和循环参数的优化 第三节 PCR反应的问题与对策 第四节 一个常规PCR实验的设计 第五节 聚合酶链式反应技术类型 第六节 聚合酶链式反应技术应用 第七节 实时荧光定量PCR技术的原理及应用,聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction ,PCR) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是近十几年来发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一。由于它具有强大的扩增能力，并且可与其他分子生物学方法(如核酸杂交)和免疫学方法(如ELISA)相结合应用，使其敏感性和特异性都大大增强，因而广泛地应用于生物医学领域的各个学科，包括基因的克隆、修饰、改建、构建cDNA文库，遗传病，传染病的诊断，法医学鉴定，物种起源，生物进化分析，流行病学调查，等等。由于PCR对世界生物医学研究的巨大推动作用，其发明者Mullis因而获得1992年诺贝尔医学奖。,最早报道的PCR是用大肠杆菌DNA聚合酶 经枯草杆菌蛋白酶处理后获得的Klenow片段来 催化DNA链的延伸。由于加热变性时酶会失活， 需要补加一份酶催化下一轮合成。这样不仅操 作复杂,而且由于酶反应的温度较低，DNA分子 会产生二级结构或引物非特异退火，使反应效 率低且易出现非特异性产物，同时，会增加污 染的机会。耐热DNA聚合酶的应用使PCR得以完 善。这种酶在加热95时不会变性，引物退火 和链的延伸可以在较高的温度下进行，因而使 得PCR的产率和特异性都大大提高。,PCR技术问世后，不仅迅速在生物医学领域得到广 泛应用，而且不断衍生出许多新的技术，使其应用范围 不断扩大，特异性和敏感性也不断提高。 比如反转录PCR(RT-PCR)是以mRNA为模板，通过 反转录反应合成cDNA，再做PCR扩增，因而可检测特异 的mRNA或得到其cDNA克隆； 如果仅有很少的序列资料，可通过锚式PCR对RNA 进行分析； 差异显示PCR（DD-PCR）可以鉴定和分离在不同条 件下(如机体或细胞受某种刺激或疾病时)某些有表达差异 的基因，而无需确切的序列资料； 免疫PCR是将PCR的强大扩增效力应用于免疫学检测 中，与传统方法相比其灵敏性要提高几个数量级； PCR- ELISA则是将PCR与核酸杂交、ELISA连为一 体，用ELISA鉴定PCR产物，避免了因使用Southern Blotting所带来的放射性污染等等。,第一节 聚合酶链式反应扩增原理 PCR是利用耐热DNA聚合酶在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的 基因体外扩增技术。它包括三个基本过程：,第一步 加热变性,靶序列,靶序列,模板DNA经94左右加热一定时间后，双链DNA解离成为单链。,第二步 引物与靶序列退火,模板DNA经加热变性成单链后，把温度降至55 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。,第三步 引物延伸,DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以 靶序列为模板，dNTP为反应原料，按碱基配对原则， 合成一条新的与模板DNA链互补的单链。,第1个 PCR 循环完成后 得到两个拷贝的靶序列,靶序列,靶序列,30次循环后靶序列扩增的数量,No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,DNA扩增量呈指数上升 反应最终的DNA扩增量可用Y(1X)n计算。 Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示每次扩增效率的平均值，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期。,PCR产物合成过程,指数期,平台期,第二节 PCR反应体系和循环参数的优化,（一）PCR反应体系 1、引物 2、耐热Taq DNA聚合酶 3、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP） 4、镁离子 5、模板 6、缓冲液 （二）循环参数 1、变性的时间和温度 2、引物退火的温度与时间 3、延伸时间和温度 4、平台效应,（一）PCR反应体系,1、引物 2、耐热DNA聚合酶 3、脱氧核苷三磷酸 4、镁离子 5、模板 6、PCR缓冲液 7、ddH2O,Mg2+,Mn2+,dCTP,dGTP,dUTP,dATP,Taq DNA 多 聚 酶,或Pfu DNA 多 聚 酶,生 物 素 标 记 的 引 物,和 或 和,dNTP,1、引物 在聚合酶链式反应中，要注意所用的引物浓度，一般引物控制在20200pmol,这种浓度通常足以保证进行30轮以上的扩增。引物浓度偏高，会引起错配和非特异性产物的扩增，同时增加生成引物二聚体的几率。相反 ，如引物浓度不足，则聚合酶链式反应的效率极低。 引物设计是否合理，是决定PCR反应成败的关键。引物设计的原则见下表：,引物3端互补后，经Taq酶聚合，形成双链的引物二聚体,引物自身的回文序列互补后产生的发夹结构,引物设计原则：,续上表,虚拟PCR可用于鉴定产物的唯一性,引物设计软件介绍,1、Primer 5.0（附中文说明书） 2、Oligo 6.0,2、耐热Taq DNA聚合酶 是一种耐热的、依赖于DNA的 DNA聚合酶，最初是从极端嗜热菌中纯化出来的。 功能：具 5 3 DNA聚合酶活性，5 3 外切酶活性（在Q-PCR中此活性有用），但不具有3 5的外切酶活性（纠错功能），导致其碱基误掺入率偏高，不适用于突变检测、测 序分析和基因表达中（可用 Pfu 高保真聚合酶代替），另外，它还具有非模板依赖性聚合酶活性，在PCR合成终止后，在3端加一个A,所以PCR产 物并非我们通常所想象的是一个平末端。利用此 特点，我们可以将PCR产物克隆到载体中。 特点：高度耐热，聚合反应的最佳温度为75 80; 价格相对便宜。在分子生物学中应用广泛。,3、三磷酸脱氧核苷酸 一般商品化供应的dNTP溶液pH为7.0，各dNTP的 浓度为 10mmol/L，一般使用浓度控制在20200umol/L。四种各dNTP分子浓度必须相等，以减少错配。dNTP可与镁离子螯合，浓度过高时，Taq酶活性降低，PCR产量会减少。,4、镁离子 镁离子浓度对PCR反应影响很大，既影响到Taq DNA聚合酶的活性和真实性，又影响到引物退火、模板和PCR产物的解链温度、产物的特异性以及引物二聚体生成等。PCR体系中的镁离子浓度一般在0.52.5mol/L。商品化的试剂盒中，镁离子浓度一 般为1.5mol/L，不同反应体系所要求的浓度会有差异。,随着镁离子浓度升高PCR 产率和特异性均降低。,镁离子浓度与产物特异性和产率的关系,5、模板 聚合酶链式反应（PCR)的模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子；可以是线状分子，也可以是环状分子，不过线状分子比环状分子的扩增效果稍好。 就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量、纯度以及目的片段的GC含量，当扩增GC富含区时，可使用专门的GC Buffer作为缓冲液。 不同来源的DNA所需模板量不同，可参考分子克隆。,6、缓冲液,1）Tris-HCl缓冲液 2）KCl 3）明胶 4）牛血清蛋白 5）非离子型生物去污剂 一般这些成分均由商家提供，并做过优化处理，不需要自己配制。,（二）循环参数 聚合酶链式反应（PCR）参数包括循环中三阶段的温度及持续时间控制，以及循环的次数，这在一定程度上影响着聚合酶链式反应的成功与否 。通常PCR 反应所采取的反应参数为： 变性温度 94 3060s 退火温度 3865 3060s 延伸温度 72 4560s 循环次数 3035次 复性温度决定于所用引物的长短与碱基组成，一般需要通过预实验来确定。,1、变性的时间和温度 模板DNA的变性不充分是导致PCR失败的一个重要原因。 一般在第一轮循环前先进行94预变性35min，以便使模板DNA完全解链。,2、引物退火的温度与时间 引物的退火温度和所需时间长短取决于反应体系中扩增的基因组成及引物的长度、浓度和碱 基组成。 实际使用的退火温度一般要比引物的Tm值低25 。 Tm4(G+C)2(A+T) 一般当引物中G+C含量高、长度较长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。 当然， 退火温度也不能过高 ，否则引物不能与模板很好得结合，得不到扩增产物。退火通常需要3060s。,退火与产物特异性的关系,3、延伸时间和温度 延伸的时间长短取决于目的序列的长度、使用的PCR仪等。 一般引物延伸是在72 下进行。对2Kb以上长片段DNA的扩增可适当延长时间 。,4、平台效应 引起平台效应的因素： （1）dNTP或引物等消耗殆尽 （2）酶活性逐渐降低 （3）最终产物的阻化作用 （焦磷酸盐、双链DNA） （4）非特异性产物或引物的 二聚体与反应模板的竞争作用,第三节 PCR反应的问题与对策,问题一、无产物 问题二、非特异性扩增 问题三、空白对照有扩增（有污染）,问题1：无产物,问题2：非特异产物扩增,问题3：空白对照有扩增,利用尿嘧啶N-糖苷酶（UDG） 解决遗留污染的方法,原理：UDG可以切断含有尿嘧啶核苷的DNA双链。 方案一：dUTP方案 是在所有的PCR反应中均用dUTP代替dTTP，这样产生的PCR产物中除引物位置外，dTTP处被dUTP代替，这并不影响对其进行克隆等操作。在每次PCR之前，均将设置好的PCR反应体系用UDG处理，那么其中的遗留污染DNA(假如有的话)将被破坏，不能作为下面PCR反应的底物，由于在后续的热变性过程中UDG将被灭活，所以事先加入的UDG不会对本反应的产物构成任何影响。,方案二：dU引物方案。 即在引物合成过程中用dUTP代替dTTP，用这类引物引导合成的PCR产物在两条链的5端引物部位含有dU，用 UDG 处理后，该区段被破坏，剩余的部分在后续的PCR循环中不能作为有效模板被扩增。 由于UDG对长于4核苷酸的DNA(单链或双链)所含的dU都能进行清除，所以在dU引物方案中需先将UDG灭活后再加入下一轮PCR的引物。,第四节 一个标准PCR实验的设计,第一步 设计引物 引物设计是否合理，是决定PCR反应成败的关键。一步走错，全盘皆错。所以，在这方面我们应多花点时间，可以避免以后少走弯路。 1）根据自己所要研究的基因，在Gene bank中找到相应的基因序列。 2）用Primer 5.0或Oligo 6.0 进行引物探针的设计。或者采用参考文献中的引物设计。 根据我的实验经验，最好参考国外的文献，等级越高可靠性越高。 （引物设计原则参见前面部分）,第二步、实验准备阶段,1）通过e-mail向公司提交引物合成申请单； 2）购买实验所需要的各种试剂或试剂盒以 及各种低值易耗品； 3）对实验所需的EP管、Tip头进行灭菌处 理（RNA提取和反应还需特别处理，请 参考分子克隆）；对引物参照说明 书进行稀释。 4）细读试剂盒说明书、熟悉操作步骤、制定 具体可行的操作方案。,第三步 实验操作阶段,基因组DNA、质粒DNA或总RNA的提取 用紫外分光光度计或荧光计检测DNA或RNA 的浓度、纯度，用琼脂糖凝胶检测是否降解 PCR（RT-PCR）反应 电泳检测PCR产物,第五节 聚合酶链式反应技术类型,1、 增效PCR 6、 RT-PCR 2、 热启动PCR 7、 PCR-VNTR 3、 降落PCR 8、 PCR-SSCP 4、 巢式PCR 9、 免疫-PCR 5、 多重PCR 10、PCR-ELISA ,1、增效PCR（booster PCR） 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经1520个循环后，再以稀释后的初级PCR产物为模板进行次级扩增，靶序列的产量将会相应增加。,2、热启动PCR（Hot start PCR）,热启动是一种在PCR反应中优化目标扩增产物的方法， 同时也能抑制非特异产物的扩增。 它通过控制PCR反应的必须组分，如DNA聚合酶或镁离 子，直到反应混合物被加热到可以阻止非特异引导和引物聚 合的温度，才加入以上成分来启动PCR反应的一种方法。 在PCR反应第一个循环之前的加温步骤可去除并降低寡 核苷酸引物非特异性复性的可能性，而DNA聚合酶活性的缺 失则阻止了错配引物的延伸。,热启动PCR 常规PCR,方 法 介 绍,1）升温后手工加酶：不方便、容易污染。 2）PE公司的蜡膜隔离法：更适用于不带热盖的PCR仪。如PE TC1、PE480。 3）单克隆抗体法：抗体与Taq酶结合抑制其活性。随 着温度的升高，抗体从酶上解离下来并在首轮PCR 循环的变性阶段被灭活，而酶的活性释放。此法适 用于各种PCR仪。 4）另一个改进方法：把Mg2+嵌入到蜡珠中，并随着 蜡的熔化而释放到反应混合液中 。,应 用,热启动PCR对于已优化的单个PCR反应没有必要。然而当非特异扩增较为严重时，热启动PCR就派上了用场。 例如当反应中的模板DNA少于10 个拷贝数 时，或当模板DNA复杂度非常高时（如哺乳动物基因组DNA），或当PCR包括几对寡核苷酸引物时， 即多重PCR (multiplex PCR) ，在这些情况下，热启动PCR和降落PCR结合有着很好的应用价值。,4,3、降落PCR （Touch Down-PCR）,降落PCR是一个很简单、实用的方法，当应 用新的引物和模板组合时，降落PCR是优化PCR最迅速的方法，当遇到诸如引导效率低，错误引 导和形成引物二聚体等问题时，降落PCR和热启 动PCR配合应用或加入GC-melt是解决问题的首选方法。,原 理,该方法是指在一次PCR过程中把复性温度设定在由高变低的一定范围内。扩增的前两个循环的复性温度应设计在比退火温度较高的那条引物的熔解温度（Tm）高大约3 左右, 在随后的循环中复性温度在每个循环中降低1 。当达到引物特异引导的许可温度时，目的序列开始扩增。而非特异性扩增则会延迟几个循环，直到复性温度降到非特异产物可以进行引导时扩增才开始。然而，这时特异性产物此时已占据绝对优势并且能有效地抑制非特异扩增产物的积累。该方法可与热启动PCR或增效PCR技术联用，作为PCR实验的常规技术。,TouchDown PCR 中温度变化规律,TouchDown PCR 中温度变化规律,4、巢式PCR（nest PCR）,此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。 除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。,在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如 果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的 区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多 个DNA片段。 多重PCR常用来检测同一基因的多个外 显子缺失；或检测某基因是否缺失或不表达 时，需同时与内对照一起扩增；另外，在法 医学鉴定中， 经常采用多重PCR同时扩增多 个STR位点来进行亲子鉴定或个体识别， 以 提高检测的效率。,5、多重PCR (Multiplex PCR),利用多重PCR对缺失突变型 DMD进行基因诊断,实线代表缺失区，虚线代表可能缺失区,6、RT-PCR,RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）得以迅速扩增（达ngug水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。,（1）基本步骤,1）RNA变性：65 75，2分钟 2）逆转录合成第一链cDNA： 依次加入各种反应混合物后，37，1小时 cDNA合成效率可通过检测掺入放性标记 物的比反射活 性来确定；cDNA分子大小可用碱性琼脂糖凝胶电泳来 鉴定。 3） 95 变性，逆转录酶灭活、RNA-cDNA杂合物变性。 4） 调整引物量（两引物的量应相等）和模板的量（一般取 逆转录产物的1/10），在一个标准PCR反应体系中扩增 目的DNA。为提高特异性可采用热启动或降落-PCR技术 5） 电泳检测结果。,RT-PCR的步骤一,oligo(dT)n,RT-PCR的步骤二,合成的 cDNA,（2）RT-PCR引物设计注意事项,1）依据实验目的不同，针对单链cDNA第一链 合成的引物可以不同，主要有三类：基因特异性引物（GSP）;多聚胸腺嘧啶核苷酸通用型引物Oligo（dT）;随机六核苷酸引物（Random Hexamers)。多数情况下使用Oligo（dT），但对不含Poly(A)尾的mRNA（如组蛋白）不适用。 2）除了要遵循常规PCR引物设计的原则之外，RT-PCR引物设计时，正向和反向引物最好结合到不同外显子的不同区域。这样可以很容易地把来源于cDNA的扩增产物和来源于污染的基因组DNA的扩增产物区分开（片段大小不同）。,（3）问题与对策,1）每完成一步都要检测，通过后再开始下一 步操作； 2）当出现非特异性带，而通过改变参数结果 仍然不理想时，可使用TD-PCR； 3）如果TD-PCR也没有扩增出特异性片段， 重新设计引物； 4）每个PCR反应都应设内对照。,7、VNTR-PCR技术,数目变异串联重复（variable number tendom repeats, VNTR）序列以各自的核心序列（通常为6bp的重复单元，如(CGG)n等，称为微卫星DNA）首尾相连多次重复，由于其重复数在人群中呈高度变异，故称为数目变异串联重复序列。它们散在地分布于染色体上，以插入/缺失方式形成多态性。 这种多态性可以通过在VNTR重复序列的两侧保守区域设计一对引物对变异区进行扩增。电泳检测，可见到长短不一的等位片段，称之为扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism, AFLP）,PCR-VNTR应用于遗传病的连锁分析,PCR-VNTR技术应用于亲子鉴定,是指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种构象差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。据此，可检测出DNA中单个碱基的替代、微缺失或插入。 通常与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行PCR扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳条带位置的差异，从而作出判断。,8、PCR-单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism,SSCP),PCR-SSCP过程,- primer - PCR扩增 产物 甲酰胺变性 单链构象DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 银染 1.为正常 结果分析 2、4、5纯合患者 3.为杂合子 .,解链,快速降温后形成特定的构像,DNA,原 理,过 程,快速置冰浴中,特 点 PCR-单链构象多态(PCR-SSCP)的优点是简单、快速、灵敏度高、成本低，可同时处理多个样本。但受温度的影响大，所以，最好用带恒温装置的电泳仪跑胶，往往可得到较理想的结果。,应 用,PCR-SSCP技术通常与测序相结合，从而构成PCR-SSCP-Sequence三联检测，可用于发现基因的未知突变或SNP。在现代分子生物学领域应用广泛。,9、免疫PCR,免疫PCR是将PCR的强大扩增效力应用于免疫学检测中，它与传统方法ELISA、放射免疫法相比其灵敏度要提高几个数量级。,10、PCR-ELISA技术,PCR- ELISA是将PCR与核酸杂交、ELISA 连为一体， 用ELISA鉴定PCR产物的一种方法， 它避免了因使用Southern Blotting所带来的放射性污染。,11、实时荧光定量PCR技术 (Real time Quantitative PCR),第六节 聚合酶链式反应技术的应用,一、核酸的基础研究（目的基因的检测及获取、突变体的构建、 T/A载体克隆PCR产物等） 二、突变检测和序列分析（PCR-SSCP、PCR-Sequence等） 三、检测基因表达（RT-PCR、DD-PCR、SSH、基因芯片等) 四、从cDNA文库中放大特定序列（利用PCR对cDNA文库的 差式筛选） 五、研究已知片段邻近基因或未知DNA片段（基于锚定-PCR 的RACE技术来获取cDNA全长） 六、进化分析（利用PCR技术扩增rRNA基因可对各物种进行 遗传聚类分析，从而确定各物种之间的亲缘和进化关系。) 七、医学应用（遗传病诊断、恶性肿瘤诊断及预后、各种病原 体的检测、移植配型等） 八、获取生物学证据（亲子鉴定、个体识别等） 九、性别控制（SRY基因的PCR检测，用于两性畸形诊断及性 连锁疾病的性别控制） 十、转基因检测（应用Q-PCR检测转基因生物的GMO基因）,第七节 实时荧光定量PCR技术的 原理及应用 (Real time Quantitative PCR),通过前面的学习，我们已经知道PCR可对特定核苷酸片断进行指数扩增。在扩增反应结束之后，我们早期采用的方法是通过凝胶电泳对扩增产物进行定性分析，也可以通过对光密度扫描来进行半定量的分析。无论定性还是半定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在绝大多数情况下，我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。而起始模板量与PCR终产物的量并不存在明显的线性关系，甚至经常是背离的。,同一个样品在96孔反应板中同时扩增，所得终产物产量差异明显。,低原始模板量的样品到平台期时产 量反而高。,例如我们想知道某一特定基因在特定组织中的表达量，显然普通PCR已不能满足我们的需求，在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。 荧光实时定量PCR技术最早于1992年由一位日本人提出的，他当时的初衷很简单，就是想实时地看到PCR反应的整个过程，由于当时EB（溴化乙锭）的广泛使用，最直接想到的标记染料就是EB， EB可以插入到双链核酸中受激发产生荧光。这样，在普通PCR仪的基础上再配备一个激发和检测的装置，第一台实时定量PCR仪就诞生了。但真正意义上的荧光定量PCR仪由美国应用生物系统公司于1996年全球首次推出。,提 纲,一、实时荧光定量PCR原理 二、实时荧光定量PCR的几种标记方法 三、实时荧光定量PCR医学和科研中的应用,一、实时荧光定量PCR原理,（一）实时荧光定量PCR原理 （二）如何对起始模板定量？,（一）实时荧光定量PCR原理,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。,实时搜集荧光信号,荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。,荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段,平台期,（二）如何对起始模板定量？,通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析。 下面介绍四个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值、标准曲线,1、扩 增 曲 线,荧光基团,横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度； 每个循环进行一次荧光信号的收集。,扩增曲线指在PCR扩增产物过程中，由定量PCR仪搜集荧光信号，并通过计算机分析后，用于描述扩增反应产物的荧光量随循环数增加而呈几何级数增长的一条曲线。,2、荧 光 阈 值（Threshold）,荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设 定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍左右。,3、Ct值,C(t) value,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。,Ct值的重现性,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则具有极好的重现性。,4、定量的计算原理,理想的PCR反应： X=X02n 非理想的PCR反应： X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率（0100之间）,C(t) value,扩增产物达到阈值线时： XCt=X0(1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: logM=logX0(1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: logX0= -log(1+Ex)Ct+logM (3) Log浓度与循环数呈线性、负相关，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。,5、标 准 曲 线,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准 品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。,确定未知样品的 C(t)值 。 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量。,6、定量结果,Log of DNA concentration,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少。 Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以 计算出样品中所含的模板量。,非特异性荧光染料标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光探针标记： 2、 TaqMan 3、Molecular Beacon 4、双探针法,二、荧光标记的不同方法,方法1：SYBR Green 法,SYBR Green,小沟,大沟,SYBR Green法 工作原理,SYBR Green能结合到双链DNA的小沟部位。,SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光。 变性时，DNA双链分开无荧光。复性和延伸时， 形成双链DNA，SYBR Green发荧光，在此阶段采 集荧光信号。,SYBR Green,SYBR Green I 工作原理,Emission,Excitation,Excitation,由于SYBR Green 与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及非特异性扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。 通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。 由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析SYBR Green PCR定量结果。,在PCR结束后，我们可以根据变性过程 中的荧光值变化绘出每个样品的熔解曲线。绘制熔解曲线时，Real-Time PCR 仪连续监测每个样品在从双链完全配对 到完全解链的升温过程中荧光值的变化 过程。,不同的扩增产物因为其长度和GC含量不同而 在不一样的温度下解链，当产物解链时，SYBR Green 的荧光值将迅速降低并被仪器监测到。 荧光强度变化的拐点即为熔解峰值。Tm值是DNA解链一半时的温度。熔解曲线是扩增反应的质控途径，当图中没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。,SYBR Green I 熔解曲线分析,Tm值：DNA解链一半时的温度,温 度,Tm值,SYBR Green I 熔解曲线分析,对荧光强度与温度的变化求副导数。(-dF/dT) 并以其作为纵座标，温度作为横座标。,Tm,-dF/dT,SYBR Green 法融解曲线分析,融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性 荧光，因此定量不准确,-dF/dT,-dF/dT,SYBR Green 法PCR的建立和优化,1. SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低荧光信号太弱，不易检测。 2. Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 可采用TD-PCR方法，提高产物的特异性。 3. MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物。 4. 反应Buffer体系的优化。 5. 反应温度和时间参数:由酶、引物、扩增片段长度及模板的种类等因素决定。 6. 其他与常规PCR相同，,SYBR Green 法应用范围,起始模板的测定。 基因型的分析。 融解曲线分析可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指 导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物 二聚体、变异产物、多种产物。,SYBR Green 法的特点,A、相对杂交探针方法，插入染料法相对较便宜。 B、不需要特别设计探针。 C、SYBR Green 是最常用的插入染料。 D、SYBR Green 染料插入双链DNA，检测灵 敏度提高200倍。 E、和杂交探针方法相比，插入染料法特异性低。 F、不能做多重PCR。 G、在延伸反应结束时搜集荧光信号。,方法2：TaqMan法,TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团(Reporter) ，如FAM、VIC等。 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher)。 探针完整时，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光； R与Q分开，发荧光。,TaqMan法工作原理,Taq酶有 53外切核酸酶活性，当其接近探针时可水解探针。将探针5端连 接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3端荧光淬灭基 团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子游离出来，实现了每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号。随着反应的进行，不断积累荧光信号。可以在循环过程中任一点检测荧光。,TaqMan 法PCR反应的建立,1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧 光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为5960 。 2、反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20秒；60，30-60秒（Taq酶53 外切核酸酶活性在60 最高），也可通过TD-PCR程序优化退 火温度；72 ，45秒。 3、优化引物和探针浓度： 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同,TaqMan法特点,A、产生很强的荧光信号； B、容易设计和合成； C、可以做多重检测； D、能够进行SNP检测； E、比插入染料贵。,方法 3：分子信标法,标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成,发夹型杂交探针,Molecular beacon(分子信标)工作原理,标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光。 它本质上是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子 呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接 近， 使得产生能量转移效应，而不发生荧光。当互 补序列出现时，探针与DNA杂交， 探针转变成一个 开放的结构，呈线性，报告荧光基团与淬灭荧光基 团彼此在空间 上产生足够的分离，荧光基团脱离了 淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。,分子信标的原理图,荧光素,淬灭基团,荧光淬灭,与模板退火形成局部双链,Molecular beacon(分子信标)应用范围,起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 SNP（单核苷酸多态性）分析,Molecular beacon (分子信标)特点,A、SNP检测。 B、多重PCR。 C、难设计、合成。 D、产生的荧光信号较低。 E、价格昂贵 。 F、在退火时搜集荧光信号。,方法4：FRET探针法,FRET探针由两条相邻探针组成，在一条探针的5 端标记FAM荧光基团， 另一探针的3端标记Red 640 （或Red 705）荧光基团。当复性时，探针结合在模板 上FAM 基团和Red 640基团相邻，激发FAM产生的荧 光，作为Red 640基团的激发光被吸收，使Red 640发 出波长为640 nm的荧光。当变性时，探针游离，两基 团距离远，不能产生640 nm波长的荧光。由于FRET探 针是靠近发光，所以检测的信号是实时信号，非累积信号。,荧光共振能量转移的原理（FRET）,荧光,FRET探针法的特点,A、特异性好； B、SNP检测； C、难设计； D、费用昂贵。 E、在退火时搜集荧光信号。,实时荧光定量PCR的优点,1 特异性好 使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时， 靶序列由引物和探针双重控制(插入染料法除外)，特异性好，假 阳性低。 2灵敏度高 荧光PCR检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、 数码显像技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。 3线性关系好、线性范围宽 由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系，通过荧光 信号的检测可以直接对产物进行定量；定量范围可在010 拷贝 毫升。 4操作简单、安全、自动化程度高、防污染。 扩增和检测可以在同一管内进行，不需要开盖，不易污染；同时扩增 和检测一步完成，不需要后期处理，不再需要担心EB和放射性污染。 5速度快、高通量 可在23小时完成96个样品的定量分析。,10,第四节 定量PCR实验的设计,1、根据自己所要研究的基因，在gene bank中找到相应 的基因序列。 2、应用相应的引物探针软件，进行引物探针的设计。 引物设计原则： A、引物与模板的序列要紧密互补； B、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构； C、引物设计的特异性要好； D、引物长度通常在20-25bp，Tm值在5565，GC含 量在4060； E、引物3端避免使用碱基A与出现3个以上的连续碱基； F、为鉴定出现基因组的扩增，引物设计最好能跨2个外 显子。,探针设计原则： A、探针位置尽可能地靠近上游引物； B、探针长度通常在20-30bp，Tm值在65-70， 通常比引物高5-10 ，GC含量在40-70。 C、探针地5端应避免使用碱基G； D、整条探针中，C的含量要明显高于G地含量； E、设计的探针特异性要好。 3、根据仪器的特点与要求，选择不同标记的荧光素。 4、引物与探针的合成及相关试剂的准备。 5、标准品地制备。 6、先做普通PCR预实验，找出最佳的PCR反应条件。,7、PCR反应体系：通常使用混合好的试剂，只需加入 引物、探针、模板与PCR水： MIXTRUE 适量 引物 0.3-0.5UM 探针 0.1-0.3UM 模板 2-5ul 水 至20-50ul 以上浓度均为终浓度，插入染料法不需要加入探针。 8、标准曲线的制作：根据情况进行10倍数的浓度稀释， 做35个梯度。 9、样本的检测，每个样本做两个复孔，每次实验均设 空白对照。 10、基线或阈值的设定。,Lightcycler 荧光定量PCR系统介绍,机器构造,配件,上机前操作过程,准备反应混和物,上机前离心,将反应毛细管插入反应盘中,上机,实验完成后倾倒毛细管的方法,特 点 1、可使用外标法定量，可加内对照，可做熔点曲线分析。 2、单一光路的三个检测点对样本同时进行三个波长的荧 光检测，扩增与检测同时进行，提供实时分析和在线 监测。引入独特的颜色补偿试剂和软件以消除个检测 通道其它染料荧光的干扰。 3、一次可做32个样本。 4、共用热室，保证单次PCR每个样本的状况连续一致。循 环速度快，20-30分钟完成30-40个循环，一次检测样本 数32个。,Lightcycler 荧光定量PCR系统,清洁和维护 反应槽和内壁均可用家用洗涤剂清洁，但反应槽必须在取出后才能进行清洁。 当毛细管破碎时，首先用仪器厂家提供的毛刷将碎片去除，再用70%乙醇清洗反应槽。 光路部分须用无水乙醇清洁。,实时荧光定量PCR仪的医学应用,临床疾病检测 定量分析：各种病毒，细菌，衣源体，支原体，病毒载量。 Her2基因、白血病融合基因等肿瘤标志物基因 检测对疾病进行诊断、疗效观察及预后。 基因分型： 病原耐药性点突变的检测(MGB)、肿瘤耐药基因 检测，避免盲目用药