《DNA提取纯化》PPT课件.ppt

Chapter 3,DNA的提取与纯化,基因工程需要三种不同的DNA: 全细胞DNA(总DNA, total cell DNA) 质粒DNA 噬菌体DNA,学习内容：,制备细胞总DNA 培养、搜集细菌细胞 制备细胞提取物 DNA纯化、浓缩 质粒DNA提取 根据分子大小分离 根据结构分离 质粒扩增 提取噬菌体DNA 噬菌体的培养、收集、纯化 纯化M13 DNA,1.制备总DNA,基本步骤： 1) 培养、收集细菌细胞 2)打碎细胞，释 放内容物 3)去掉DNA以外 的成分 4)DNA溶液的浓缩,1.1培养、搜集细菌细胞,两种类型的细菌培养基的成分： M9培养基(确定成分培养基)：g/L Na2HPO4(6.0) KH2PO4(3.0) NaCl(0.5) NH4Cl(1.0) MgSO4(0.5) 葡萄糖(2.0) CaCl2(0.015) LB培养基(不确定成分培养基) ：g/L typtone(10) 提供氨基酸以及肽段 Yeast extract(5) 提供氮源、糖类、有机和无机营养 NaCl(10),1.1培养、收集细菌细胞,37C，150-250rpm培养10小时左右。 达到最大浓度2-3109cell/ml。 600nm下的OD值，1OD相当于0.8109cell/ml 。,Harvesting bacteria by centrifugation,1.2 制备细胞提取物,利用溶菌酶、EDTA或两者结合。 溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分泌物中，能消化细胞壁的多聚物。 EDTA络合保持细胞结构完整的钙离子，也可以抑制DNA酶的活性。 提取液中同时还加入SDS，使细胞膜破裂，协助细胞壁的溶解。,Preparation of a cell extract.,Preparation of a cell extract,1.3 DNA的纯化,去掉DNA以外的成分 蛋白酶K/苯酚蛋白质 RNA酶RNA,Removal of protein contaminants by phenol extraction., Purification of DNA from a cell extract,DNA的浓缩 最常用的浓缩方法是乙醇沉淀（同时含有Na离子的条件下）。DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者离心沉淀（杂质）。,1.4 DNA的浓缩以及浓度、纯度的测定,1.4 DNA的浓缩与浓度、纯度的测定,DNA浓度的测定 260nm下测定吸光度，1OD相当于50g双链DNA/ml（ 40g单链DNA或RNA/ml ）。 电泳检测,核酸具有结合染料的能力,溴化乙锭 Ethidium bromide, EtBr, EB,EB与DNA结合的多少与DNA分子的大小及其分子的数目成正比，因此荧光强度的大小可所反映DNA片段的大小及其数量。,DNA浓度的测定 琼脂糖凝胶电泳检测,琼脂糖(Agarose)是从海藻中提取的一种线状多糖高聚体。,琼脂糖凝胶电泳的制备和检查,配制缓冲液等 配制琼脂糖凝胶 装备电泳装置 核酸上样 核酸迁移 观察,TAE TBE TPE,琼脂糖凝胶电泳的制备和检查,溴酚兰作用？,琼脂糖凝胶电泳的制备和检查 P102,电泳检测,1.4 DNA的浓缩与浓度、纯度的测定,DNA纯度的测定 A260/A280=1.8， 1.8说明有RNA。,The use of an anion-exchange chromatography resin in DNA purification.,DNA的纯化离子交换层析法 P101,1.5植物总DNA 的提取,CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵) 去污剂， CTAB在低盐浓度下与核酸结合，在 高盐浓度下又与核酸分离。适用于糖、脂含量较高的植物。 SDS法(十二烷基磺酸钠) 去污剂，使细胞膜破裂，协助细胞壁的溶解,CTAB法提取植物DNA,2 质粒DNA提取,根据质粒DNA的大小（质粒分子最大不超过大肠杆菌染色体的 8%） 根据DNA的构造 碱裂解法 Alkaline denaturation EBCsCl密度梯度离心法 Ethidium bromide-caesium chloride density gradient centrifugation,2质粒DNA提取,2.1 根据分子大小提取质粒DNA 在蔗糖存在时用EDTA和溶菌酶处理，可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整； 用非离子去垢剂如Triton X-100处理，诱导细胞裂解； 离心分离，小分子质粒位于裂解液上清；而细菌大分子DNA则沉淀下来。,2.1 根据分子大小提取质粒DNA,问题： 裂解液中不可避免的包含一些染色体DNA。 质粒分子非常大时 ，将与细胞残留物共沉淀。,2.2 根据分子构造提取 碱裂解法 在非常窄的pH范围内，非超螺旋化的DNA会变性，而超螺旋化的质粒DNA不变性。 在裂解液中加入氢氧化钠，调pH值至12.012.5，破坏氢键，使非超螺旋化的DNA变性。加入酸，变性的细菌DNA进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。 同时利用SDS裂解，KAc中和可以去掉大部分的蛋白质和RNA。上清液中只剩下超螺旋化的质粒DNA了。,Plasmid purification by the alkaline denaturation method.,Alkaline denaturation,溶液 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA，20mmol/L 20mM Tris-HCl pH8.0， 100g/ml RNase A 溶液0.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAC, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O,微量提取质粒的溶液 P100,取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100l溶液 ，充分混匀; 加入200l新配制的溶液 ，加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min; 加入150 l溶液 ，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min。,微量提取质粒的方法：,I 型：超螺旋环状 II 型：带切口环,DNA分子的构象 P102,Circular forms of DNA migrate in agarose distinctly differently from linear DNAs of the same mass. Typically uncut plasmids will appear to migrate more rapidly than the same plasmid when linearized. Additionally, most preparations of uncut plasmid contain at least two topologically-different forms of DNA, corresponding to supercoiled forms and nicked circles. The image to the right shows an ethidium-stained gel with uncut plasmid in the left lane and the same plasmid linearized at a single site in the right lane.,2.2 根据分子构造提取,EBCsCl密度梯度离心法 在较大的离心力条件下，CsCl形成梯度，生物大分子形成不同的条带，条带的位置取决于其浮力密度。 最上部是蛋白质，中间是DNA，下部是RNA。,CsCl density gradient centrifugation.,CsCl density gradient centrifugation,Partial unwinding of the DNA double helix by EtBr intercalation between adjacent base parirs.,EB,EB如何与DNA结合?,2.2 EBCsCl密度梯度离心法,EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，线形DNA大约会降低0.125g/cm3；但超螺旋的DNA结合EB少，浮力密度降低较小，仅降低0.085g/cm3。 EB可以用丁醇抽提。 CsCl可以用透析除去，纯度可达100%。,Purification of plasmiod DNA by EtBr-CsCl density gradient centrifugation,如何分离质粒DNA？,2质粒DNA提取,2.3 质粒扩增 一些多拷贝质粒具有在无蛋白合成条件下复制的能力。当细胞增加到足够数目时，加入蛋白合成抑制剂如氯霉素，继续培养。在这个过程中，质粒分子继续复制，但染色体的复制和细胞分裂已经停止，可以获得上千个拷贝。,Plasmid amplification, Plasmid amplification,Inhibitor of protein synthesis: Chloramphenical, 12h,3 噬菌体DNA的制备,当培养物离心时，细菌沉淀到底部，噬菌体留在悬浮液中，去蛋白就可以获得噬菌体DNA。 然而获得大量的噬菌体DNA是一个障碍。每ml菌液可以获得1010噬菌体，但只能产生500ngDNA。,3 噬菌体DNA的制备,3.1 噬菌体的培养 自然培养的噬菌体是溶源性的。要获得大量的细胞外噬菌体，必须经过诱导培养使所有的噬菌体都进入裂解周期，使细胞死亡释放噬菌体。,3.1 噬菌体的培养,大部分实验室都使用cI突变的温度敏感突变体。cI基因可以使噬菌体保持整合状态，突变后转变成溶菌性的。在cI突变体中，cI基因在30C条件下正常表达，在42C时，不能正常表达，产生溶菌性。,Induction of a cl lysogen by transferring from 30 to 42,Lysogenic phage,At 30 , cl gene protein works, Keep lysogeny: At 42 , cl gene protein does not work, produce extracellular phage.,Achieving the right balance between culture age and inoculum size when preparing a sample of a non-lysogenic phage,Non-lysogenic phage（Lytic),由于缺失修饰，大多数基因工程载体属于此类型。,3 噬菌体DNA的制备,3.2 噬菌体的收集 噬菌体颗粒非常小，所以只有高速离心才能沉淀。通常利用PEG沉淀病毒颗粒，形成多聚体。离心可以收集噬菌体，重新溶解在少量的溶液中。,Collection of phage particles by polyethylene glycol(PEG) precipitation,Collection of phage particles,3 噬菌体DNA的制备,3.3 从噬菌体中纯化DNA PEG沉淀物中可能含有少量的细菌裂解物，也可能含有细菌DNA。这些组成部分可以通过梯度离心去掉。除去CsCl后可以获得纯净的噬菌体。然后通过酚抽提或者蛋白酶处理蛋白质外壳。,Purification of p