PDCD5的发现和功能研究.pps

1,PDCD5的发现和功能研究 北京大学医学部 马大龙,2,前言,“Life cannot exist without death”；每个人每天有5千万到7千万个细胞死亡。 细胞凋亡（Apoptosis）是程序化细胞死亡（Programmed cell death,PCD）的一种形式，在细胞分化、增殖、生长和疾病中起着重要的作用。如果机体缺乏凋亡，一个80岁的老人将有2吨重的骨髓和淋巴节，16公里长的肠道（Nature,412:23,2001）.,3,凋亡缺陷导致的疾病： 肿瘤、SLE、多发性硬化症、糖尿病、类风湿关节炎等 凋亡过强导致的疾病： AIDS、中风、神经退行性疾病、脊髓损伤等,4,提出思路,克隆化新的凋亡调控基因，将有助于阐明凋亡机理，为凋亡异常疾病防治提供基础。 细胞凋亡过程中，将有一些基因表达改变，特别是上调表达基因，可能发挥重要的凋亡调节作用。,5,1999年,利用cDNA-RDA（Representative Differences Analysis）技术,本室从诱导凋亡的TF-1细胞克隆了凋亡上调表达的人类新基因, 命名为TFAR19 (TF-1 apoptosis related gene), 2001年国际基因命名委员会命名为PDCD5 (Program Cell Death 5),6,RDA技术路线图,7,正常培养的TF-1细胞(Driver),进入凋亡的TF-1细胞(Tester),三轮cDNA-RDA,DNA测序和基因库检索,用Slot Blots和Northern Blots检测表达的差异,RACE方法克隆PDCD5的全长序列,PDCD5在E.coli中的表达、纯化,PDCD5真核表达载体的构建,PDCD5的胞内定位,抗体制备和免疫检测,PDCD5蛋白质的活性研究,PDCD5转染的活性研究,PDCD5在组织和细胞中表达检测,8,Result of Northern blots of PDCD5/TFAR19,Left is RNA from normal-cultured TF-1 cell Right is RNA from TF-1 cell undergoing apoptosis,9,Sequence of PDCD5 cDNA,CTG CTC CAG CGC TGA CGC CGA GCC ATG GCG GAC GAG GAG CTT GAG GCG CTG AGG AGA CAG AGG CTG GCC GAG CTG CAG GCC AAA CAC GGG 90 MET Ala Asp Glu Glu Leu Glu Ala Leu Arg Arg Gln Arg Leu Ala Glu Leu Gln Ala Lys His Gly GAT CCT GGT GAT GCG GCC CAA CAG GAA GCA AAG CAC AGG GAA GCA GAA ATG AGA AAC AGT ATC TTA GCC CAA GTT CTG GAT CAG TCG GCC 180 Asp Pro Gly Asp Ala Ala Gln Gln Glu Ala Lys His Arg Glu Ala Glu MET Arg Asn Ser Ile Leu Ala Gln Val Leu Asp Gln Ser Ala CGG GCC AGG TTA AGT AAC TTA GCA CTT GTA AAG CCT GAA AAA ACT AAA GCA GTA GAG AAT TAC CTT ATA CAG ATG GCA AGA TAT GGA CAA 270 Arg Ala Arg Leu Ser Asn Leu Ala Leu Val Lys Pro Glu Lys Thr Lys Ala Val Glu Asn Tyr Leu Ile Gln MET Ala Arg Tyr Gly Gln CTA AGT GAG AAG GTA TCA GAA CAA GGT TTA ATA GAA ATC CTT AAA AAA GTA AGC CAA CAA ACA GAA AAG ACA ACA ACA GTG AAA TTC AAC 360 Leu Ser Glu Lys Val Ser Glu Gln Gly Leu Ile Glu Ile Leu Lys Lys Val Ser Gln Gln Thr Glu Lys Thr Thr Thr Val Lys Phe Asn AGA AGA AAA GTA ATG GAC TCT GAT GAA GAT GAC GAT TAT TGA ACT ACA AGT GCT CAC AGA CTA GAA CTT AAC GGA ACA AGT CTA GGA CAG 450 Arg Arg Lys Val MET Asp Ser Asp Glu Asp Asp Asp Tyr Stop AAG TTA AGA TCT GAT TAT TTA CTT TGT TTA TTG TCT ATA GCC TTT TAA AAA AAT AAA CTT GTT ATG CAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 540 AAA AAA AAA AAA AAA AAA,PDCD5编码蛋白结构比较简单,全长125个氨基酸，不含二硫键， pI 5.65 ; 无信号肽，无跨膜序列，与已知人类蛋白无同源性;S118可以被CK2磷酸化,10,PDCD5基因结构图,（染色体19q12-q13.1）,cDNA,867bp,2718bp,804bp,950bp,323bp,Exon1 (90bp),ATG,TGA,Exon2 (38bp),Exon3 (62bp),Exon4 (92bp),Exon5 (72bp),Exon6 (167bp),基因组DNA,558bp，编码125个氨基酸,11,PDCD5蛋白在不同种属中序列高度保守,12,PDCD5 3-D modeling,（根据1EIJ模建）,13,如何开展基因功能研究,1。构建真核表达质粒，转染细胞，通过基因过表达（Overexpression）研究基因功能。 2。构建绿色荧光蛋白表达质粒，观察细胞定位。 3。表达重组蛋白，观察其对细胞的影响。,14,pGEM-TTFAR19,EcoR I,EcoR I,LacZ,fi ori,ori,TFAR19,AmpR,EcoR I,T4 Ligase,Construction of pcDITFAR19,15,PDCD5过表达促进 HeLa和 MGC-803 细胞撤除血清诱导的凋亡,16,Detection of apoptotic cells of stable transfectants of HeLa cell induced by withdrawal of serum using Annexin V,pcDI,pcDITFAR19(+),pcDITFAR19(-),(488nm, X400),17,PDCD5对各种细胞具有促凋亡效应,但不能诱导凋亡,18,SV40 poly A,pEGFP-C3,CMV IE,NeoR,EGFP,EcoR I,Sal I,AmpR,Sma I,BamH l,SV40 poly A,pEGFPC3PDCD5,CMV IE,NeoR,EGFP,BamH I,TFAR19,AmpR,Sma I,BamH l,Sma I,MCS,Tfar19 PCR Product,BamH I,Sma I,Xho I,Xho I,Klenow,Sal I,EcoR I,Klenow,T4 Ligase,Construction of expression vector of pEGFPC3-TFAR19,19,Cellular localization of PDCD5 in nucleus,Green Fluorescein Protein staining (488nm),DAPI staining (DAPI wave length),20,Nuclear translocation of PDCD5 in Hela cells treated with VP16,0 hour 30min,2 hours 8 hours,21,Nuclear Translocation of PDCD5 in TF-1 Cells After GM-CSF deprivation.,A: Cells were stained with FITC-labeled 3A3 antibody at different time points, and observed using CLSM. B: Cells were cultured in GM-CSF-free medium for 16h, then stained with FITC-3A3 and DAPI. Nuclear accumulation of PDCD5 and condensed nuclei were obviously observed.,Yingyu Chen et al:FEBS Letter， 2001，509: 191,22,pL,pMTY-4,AmpR,Xho I,Stu I,Thrombin Linker,MS2,EcoR I,Pst I,PDCD5 ORF PCR Product (410bp),pL,pMTY-TFAR19,AmpR,Xho I,Thrombin Linker,MS2,EcoR I,Pst I,TRAF19,Sma I,Bgl I,Xho I,Xho I,Stu I,Klenow,Xho I,T4 Ligase,Construction of E.coli expression vector of pMTY4-TFAR19,23,Expression and purification of PDCD5 in E. coli,M. protein marker from Promega 1. uninduced whole bacteria 2. induced whole bacteria 3. cut after thrombin 4. purified PDCD5 protein,24,Western Blots to detect expression of PDCD5 protein in normal-cultured TF-1 cells and apoptotic TF-1 cells,Left is protein from apoptotic TF-1 cells Right is protein from normally- cultured TF-1 cells,25,Purified protein of PDCD5 could promote the apoptosis of TF-1 cells induced by cytokine withdrawal,26,重组蛋白PDCD5能够明显抑制IDR诱导的K562细胞的克隆形成数目,27,人PDCD5蛋白的穿膜效应研究 （JBC，2006，281:24803 ）,本实验室证明人PDCD5蛋白可以通过clathrin非依赖的途径从细胞外携带生物大分子到细胞内，109-115氨基酸是其活性功能区。通过细胞膜的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)介导. PDCD5的穿膜效应提示其可以作为重组蛋白药物发挥促进肿瘤治疗效应,28,Exogenous p53N-PDCD5 induces apoptosis,29,如何封闭PDCD5的功能？,PDCD5单克隆抗体的细胞内导入 PDCD5反义寡核苷酸 PDCD5反义RNA表达质粒 PDCD5 RNA干扰,30,(Rui et al, Life Science，2002),Monoclonal antibody of PDCD5 can inhibit etoposide induced HeLa cells apoptosis,31,A T G,Sequence of oligonucleotides used in pilot experiment and diagram of corresponding regions to ORF of PDCD5,32,FACS results of Jurkat cell apoptosis treated with oligonucleotide,No oligo,sense,AS3,AS2,AS1,33,Sequence of phosphorothioate oligonucleotides to PDCD5,Antisense oligos 5-A A G C T C C T C G T C C G C C-3 Control oligos 5-C A C C T A C C C A T C G G A C-3 Sense oligos 5-A T G G C G G A C G A G G A G C-3,34,Inhibition of human PDCD5 protein through antisense oligonucleotide treatment,35,Inhibition of Apoptosis triggered by VP16 in Jurkat cells by antisense oligonucleotide to PDCD5,36,MAIN APOPTOSIS PATHWAYS,37,Caspase activation by proteolytic cleavage,38,Antisense oligonucleotide to PDCD5 inhibit Caspase-3 Activity in dose-dependent manner,39,Antisense oligonucleotide to PDCD5 inhibit Caspase-3 Activation,1. No oligo, VP16- 2. No oligo, VP16+ 3.sense oligo, VP16+ 4. Control oligo, VP16+ 5. Antisense oligo, VP16+,40,Antisense oligonucleotide to PDCD5 doesnt inhibit activation of pro-caspase-9,1. No oligo, VP16+ 2.sense oligo,VP16+ 3.antisense oligo, VP16+ 4. Control oligo, VP16+,41,The targeting sequences of PDCD5 siRNAs,42,The effect of PDCD5 siRNA,pGC-Non-silencing,pGC-siPDCD5,A.,Non-silencing siRNA,siPDCD5,B.,C.,43,siPDCD5 attenuates cell apoptosis induced by Bax overexpression,44,siPDCD5 reduces procaspase-3 cleavage and caspase-3 activity,Linnan Chen et al:Apoptosis. 2006, 11(1):101-111,45,分子机制研究,Pulldown 、Co-IP？、ELISA实验证明PDCD5结合Caspase-3，促进Caspase-3的稳定性.,ELISA for PDCD5-Caspase3 interaction,46,PDCD5对caspase-3 稳定性的影响(in vitro),47,德国Stelzl等2005年利用规模化酵母双杂交发现PDCD5结合HTATIP（组蛋白乙酰转移酶, TIP60）、EEF1（翻译延伸因子）、RIF1（酵母端粒蛋白同源分子）、ACP5（酸性磷酸酶） 加拿大Ewing等2007年利用规模化质谱分析发现PDCD5结合VHL（抑癌基因）和GC20（可能的翻译起始因子）,48,本实验室利用多指标证明PDCD5结合TIP60，促进组蛋白乙酰化 （Xu LJ et al:Neoplasia, 2009, 4:345-354）,49,Possible mechanism for the Functions of PDCD5 in Apoptosis,50,PDCD5,VHL,Active caspase-3,Nuclear translocation,TIP60,Histone,P53,Apoptosis,Acetylation,?,Acetylation,PDCD5可能的分子作用机制,51,PDCD5从基础到临床,在疾病时情况下的是否表达异常？ 遗传变异是否影响疾病易感性？ 有无临床诊断价值？ 是否有治疗价值？,52,Expression of PDCD5 mRNA in different human tissues,53,PDCD5在肿瘤中的下调表达,1。肝癌（PNAS，中国普通外科杂志） 2。乳腺癌（NEJM） 3。白血病（北医学报，Leukemia Res） 4。子宫颈癌（北医学报） 5。口腔鳞癌（北医学报） 6。卵巢上皮癌（中国妇产科临床杂志） 7。甲状腺乳头状癌（中华内科杂志） 8。银屑病（中华皮肤科杂志） 9。胃癌，预后相关（Apoptosis） 10。肺癌（J Clin Oncol ） 11.肾透明细胞癌，预后相关（南方医科大学学报） 12。脑星型胶质瘤（Oncol Rep） 13。多发性骨髓瘤（中南大学学报） 14.骨肉瘤（Apoptosis），预后相关（J Surg Oncol） 15.前列腺癌（Chin Med Sci J）,54,PDCD5的表达与肾癌预后相关 南方医科大学学报，2006，26(9)：1316-1318,55,PDCD5的表达与胃癌预后相关 Apoptosis, 2006, 11(6):993-1001,56,PDCD5的表达与骨肉瘤预后相关 (J Surg Oncol. 2010 Sep 24. Epub ahead of print),57,上调表达 1。系统性红斑狼疮（中华风湿病学杂志） 2。老年性白内障（眼科研究） 3。骨关节炎（Acta Pharmacol Sin） 4。桥本病甲状腺（中华内分泌代谢杂志） 5。多囊卵巢综合征（北医学报）,58,PDCD5 启动子区的功能性SNP,本实验室首次发现在PDCD5启动子区存在2个连锁不平衡的SNP： -11G/-27A or -11A/-27G 前者比后者明显高表达PDCD5 白血病患者的杂合子频率明显高于正常人 Xi Ma, et al:Clin.Cancer.Res. 2005, 11:8592,59,PDCD5 5调控区两个新SNP的发现,SNPs的筛选：45个样本直接测序（-11位和-27位同时出现SNP）,60,PDCD5 SNP在HeLa细胞的启动子活性,61,PDCD5 SNP在HeLa细胞凋亡的启动子活性,HeLa细胞 撤血清诱导凋亡,62,PDCD5启动子区SNP的CML基因型频率,Heterozygous ratio: 25.58% 、11.85,63,PDCD5 SNPs 在AML患者中的研究,64,RQ-PCR检测不同基因型CML患者 PDCD5的mRNA水平,65,66,Spinola等通过SNPs全基因组扫描技术，发现PDCD5基因上游35kb处的SNP与肺癌发病相关，GG或CG基因型携带者肺癌发病风险升高；肺腺癌组织中PDCD5的mRNA比正常肺组织低2.4倍。超表达该基因的人NCI-H520细胞系克隆形成能力明显下降。作者认为PDCD5可能是新的抑癌基因（J Clin Oncol，2006）,67,PDCD5在肿瘤治疗中的应用,根据肿瘤治疗现状来看，化学药物治疗仍然是目前主要的治疗手段之一，但由于化疗药的毒性作用，限制了化疗的应用。 化疗增敏剂可在亚适剂量化学药物剂量下，提高化学药物疗效，降低其对正常组织细胞毒性，产生抗肿瘤细胞的协同效应，具有重要的临床意义。,68,PDCD5腺病毒在裸鼠体内对K562细胞的化疗增敏效应 （Apoptosis. 2008, 13(5):641-648 ）,69,裸鼠瘤内注射PDCD5重组蛋白增加K562细胞对IDR的敏感性。 单纯化疗药IDR的抑 瘤率达60.27%时， IDR联合PDCD5抑 瘤率可达92.03,(Lin Shi et al: BBRC, 2010, 396:224),70,裸鼠腹腔注射PDCD5重组蛋白增加K562细胞对IDR的敏感性：平均瘤块57.7mm3开始治疗,71,重组PDCD5腹腔注射联合IDR治疗实验各组小鼠移植瘤重量,*同单独化疗药相比，差异具有统计学意义， P0.05；*同单独化疗药相比，差异具有统计学意义， P0.001；同伊马替尼治疗相比，差异具有统计学意义，P0.05；同伊马替尼治疗相比，差异具有统计学意义，P0.01,（肿瘤平均体积达到140 mm3开始治疗）,72,重组PDCD5对骨肉瘤的化疗增敏作用研究,*p0.01 vs. control *p0.001 vs. control #p0.01 vs. cisplatin Cisplatin: 2mg/