《文库的构建小结》PPT课件.ppt

基因文库（Gene library）：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体, 称之为基因文库。一个完全的基因文库，应该能够保证从中筛选到目的基因。 即 Genomic library,第五章 DNA文库的构建 DNA libraries,1976年L.Clark J.Carbon提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式 n=ln(1-p)/ln(1-f) n: 一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数 p: 所期望的目的基因在基因文库中出现的几率 f: 插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值,cDNA文库: 若这些大量的重组DNA分子所含的外源DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组DNA克隆群体，则称之为cDNA基因文库,一、cDNA克隆用的mRNA 1. mRNA的完整性,第二节 cDNA文库的构建,基因特异性 器官特异性 不均匀性 mRNA的大小 500bp8kb 大部分 1.52kb,2mRNA的丰度 常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：15% mRNA，8085% rRNA，1015% tRNA 高丰度mRNA 珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白 在特定细胞中占50-90% 低丰度mRNA 0.5% 被称为低丰度或稀有mRNA,文库应足够大，鉴定和分离困难,反转录酶 AMV (42) M-MuLV (37) RNase H RNase H弱 长mRNA 引物 oligo(dT) 12-18 一般要求浓度高 模板 氢氧化甲基汞预处理，减弱链内二级结构 RNase 抑制剂,AAAAAAA,mRNA,5,3,TTTTTTTT,二、cDNA第一链的合成,cDNA,1自身引导法,三、cDNA第二链的合成,NaOH处理 需用S1酶,2. 置换合成法,RNaseH, Coli. DNA poly.1, lingase,有效 无须进一步纯化 不需用S1酶，否则会导致cDNA酶的大量损失,问题： 如何脱帽以便进入载体 5端cDNA不能合成（少几个Nt） 有可能仍形成发夹结构,3. 第二链引导合成,Okayama-Berg方法,4. 引物-衔接头合成法,四、ds cDNA的分子克隆,1.同聚物加尾,问题： 只对质粒有效，文库不易保存和复制。 尾的长短不一 (100dA/dT, 20dG/dC) 同聚尾结合的质粒：cDNA杂合分子转化E.coli的效率随宿主不同而不同。,2合成接头和衔接头,cDNA,合成接头 (含酶切位点),酶切,NotI, SalI,与载体连接,Optional: methylation,接头中含稀有位点，如NotI, SalI(100kb一次),先甲基化ds cDNA，再连接接头,用衔接头替换接头,接头中含稀有位点，如NotI, SalI(100kb一次) 先甲基化ds cDNA，再连接接头 用衔接头替换接头,3. 其他方法,mRNA-cDNA杂交体克隆,依次连加不同接头,其他与cDNA第二链合成有关的方法，如 Okayama-Berg方法和引物-衔接头合成法,3. 其他方法,(1) mRNA-cDNA杂交体克隆,mRNA,cDNA,AAAA,AAAA,RNA 末端加尾效率 只及DNA的1/10,合成第一链后, 加尾, 与带dT尾的载体退火, 在宿主体内, 可除去RNA, 代之以DNA,优点: 无须合成第二链, 序列完整 但效率 1/10,(2) RACE random amplification of cDNA ends,cDNA克隆是常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长cDNA克隆 筛选文库是一般只能针对一个或几个cDNA克隆， 而RACE可产生大量独立克隆,mRNA,cDNA,TTTTTTTT-QI-QO,AAAAAAA,1. 经典RACE,3末端克隆,TTTTTTTT-QI-QO,反转录,QO,PCR,GSP1,QI,GSP2,根据已经得到的不完整的cDNA的序列设计引物 GSP1,和GSP2,PCR,cDNA克隆中, 得到了不完整的片段, 可采用此方法获得3末端和5末端的序列,5末端克隆,mRNA,AAAAAAA,GSP1,GSP1,AAAAA,Q1-Q2- TTTTTT,Q1/ GSP1 PCR,反转录,Q2/ GSP2 PCR,GSP2,获得的cDNA 克隆片段,AAAAAAA,GSP1,反转录,连接RNA寡聚物,NNNNNNNN,2. 新RACE,第三节 基因克隆的策略,基因克隆的本质 从文库中筛选目标克隆，重点在“筛选”,常见筛选工具: 探针,狭义: 核酸, 抗体 广义: 还包括其他筛选手段,抗性基因: antibiotics抗性基因, 抗重金属活性,一、功能筛选,分解基因: 苯环化合物, 分解酶,功能活性：杀虫，酶,启动子/复制子,利用目标基因的特定功能进行筛选,Amp ori,MCS,Tet gene without promoter,功能缺失,在获得相应突变体的前提下 以此突变体作为宿主 在野生型的DNA导入后检测回复突变,如 营养缺陷型 相关的基因,二、核酸探针,同源DNA探针,高度保守的基因 rRNA基因,邻近种属的相应基因,相应基因的序列比较,合成寡核苷酸,蛋白质N-末端aa序列,简并探针degeneracy 选取简并程度低的aa序列,综合合成,可能的话 设计一对, 用PCR产物作探针,根据密码子的使用频率, 合成猜测体探针,设计两组简并探针, 用第二个探针对第一次筛选的阳性克隆子作第二次杂交,三、免疫 在可获得PT后, 制备抗体, 用于筛选,六、mRNA差别显示,PRIMER R 12 5 GATCTGCGGTGA 3 3 CTAGACGCCACT 5 R 24 5 TGCGGTGAGAGGCTGGAGAGTGCT 3 3 ACGCCACTCTCCGACCTCTCACGA 5 J 12 5 GATCTGTTCATG 3 J 24 5 TGTTCATGGATAGTCGACGTCGGT 3 N 12 5 GATCTTCCCTCG 3 N 24 5 TTCCCTCGGATAGCACAGTTGCCT 3 DpnII 酶切双链cDNA产生粘性末端, 每对引物之间退火后两两互补可形成DpnII的酶切位点， 3对接头(引物) 中, 1对制备扩增子,另外2对用于杂交和扩增的过程中。,R 12 5 GATCTGCGGTGA 3 3 CTAGACGCCACT 5 R 24 5 TGCGGTGAGAGGCTGGAGAGTGCT 3 3 ACGCCACTCTCCGACCTCTCACGA 5,5 GATCTGCGGTGA 3 ACGCCACTCTCCGACCTCTCACGA,5 TGCGGTGAGAGGCTGGAGAGTGCT 3 CTAGACGCCACT,3 AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA 5 AGTGGCGTCTAG,5 GATCTGCGGTGA 3 ACGCCACTCTCCGACCTCTCACGA,3 AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA 5 AGTGGCGTCTAG,合成driver and tester cDNA Dpn II酶切两组双链cDNA R24、R12 及DNA 连接酶 连接Dpn II酶切的cDNA 以R24 为引物分别PCR扩增处理组和对照组 用Dpn II 充分酶切, 切掉R24的接头, 即得到扩增子作为driver 更换接头, 连接J24、J12 到扩增子, 建立1个试验者群体。 Tester以1100 分子比例与driver 混合, 在95 96变性, 67杂交, 在两cDNA 群体间成对比较 用J24引物PCR扩增, T:D 呈线性递增, 产物单链DNA , T:T 杂交体呈指数递增, 且为dsDNA 分子, D:D 杂交不能进行PCR 扩增,第六章 重组DNA导入宿主,转化 转导 转染 感染 结合 其它,一、转化 transformation,一种遗传转移方式,1928年 Griffith 首次发现,肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae）,少量无毒RII（无荚膜，粗糙） 大量杀死有毒SIII（有荚膜，光滑）,混合注射小白鼠,鼠死可分离出活SIII细胞,RII细胞 + SIII DNA,即一来自一个细菌细胞(供体)的DNA(片段)被另一个细胞(受体)所吸收(随后同受体染色体一起进行重组),对DNA的吸收，仅在受体生长周期中的一个短暂阶段。能够吸收DNA的细胞，称作感受态细胞(competent cell),在转化中有功能的DNA是双链或ssDNA， 线状或环状,（一）CaCl2转化法 核心，目标细胞在CaCl2H2O溶液中浸泡一段时间,E.coli：100mM,E.coli: DH5, TG1, XL-1Blue, JM105,冰上30min 热激42 90 恢复 12min 复苏 37 45-60 min,转化效率107-109 cell/gDNA,转化子（transformant）,转化后的受体菌，称转化子,（二）原生质体转化法 protoplast,G+细菌，特别是芽胞杆菌，酶母 Lysozyme / 等渗环境下，脱细胞壁,细胞壁再生,(三)电转化法（electroporation） 10%甘油或蔗糖，含(或不含)Mg2+ 离子 2.5 KV/0.4cm 25F 200-400,Gene Pulse, Bio-Rad 公司,电转杯,由噬菌体将细菌基因由一个细菌（供体）转移到另一个细菌（受体）的过程,二、转导（transduction）,（一）普遍性转导 (generatized transduction),phage在供体中烈解中，部分供体DNA被包装，当感染受体菌时，若感染变数小于1时，缺陷phage可将供体DNA注入受体(此时原phage DNA不感染) 形成新的表型,但这种表型不一定稳定，因为供体DNA不一定与受体发生重组，故此类转导称流产转导（abortive transduction），否则称完全转导(complete transduction),(二) 局限性转导 Specialized (or restricted) transduction, phage 不正确切离时以10-6比率 产生dgal （半乳糖基因）或dbio（生物素基因）,以温和噬菌体为媒介，将供体细菌染色体的特定部分转移给受体细菌的过程。 噬菌体DNA直接参与了转导过程。,dgal,双重溶源菌进入裂解状态可产生两种噬菌体,感受态细胞经分离出来的噬菌体核酸所感染，随后能产生出正常噬菌体后代，叫转染,三、转染 (transfection),这一过程与转化是相同的， 区别：使用的质粒载体换成了噬菌体。 转染； 体外包装 A. 缺陷性噬菌体 B.两个缺陷性噬菌体株,两个缺陷性噬菌体株