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文档简介
对流免疫电泳,一、基本原理 在pH值8.6的琼脂凝胶中,抗体球蛋白只带有微弱的负电荷,而且它分子又较大,所以泳动慢,受电渗作用的影响也大,往往不能抵抗电渗作用,故在电泳时,反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷,分子又较小,所以泳动快,虽然由于电渗作用泳动速度减慢,但仍能向正极泳动。如将抗原置阴极,抗体置阳极,电泳时,两种成分相对泳动,一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇,并在比例适当的地方形成肉眼可见的沉淀线。这样由于电泳的作用,不仅帮助抗体定向移动,因而加速了反应的出现,而且也限制了琼脂扩散时,抗原抗体向四周自由扩散的倾向,因而也提高了敏感性,本法比琼脂扩散法的灵敏度要高1016倍,而且反应时间短,可用于各种蛋白的定性和半定量测定。,二、对流免疫电泳 即双扩+电泳技术 用途:同双扩 优点:快、敏感性高 缺点:分辨力低,三、操作方法 1制琼脂板 以pH8.6离子强度0.05巴比妥缓冲液配成1%1.5%琼脂凝胶板,厚度2mm3mm。 2打孔 琼脂冷却后,按图打孔,打成对的小孔数列,孔径0.3cm0.6cm,孔距0.4cm1.0cm。挑去孔内琼脂,封底。 3加样 一对孔中,一孔加抗原,另一孔加抗体。 4电泳 将抗原孔置于负极端。电流强度3mA/cm6mA/cm,电泳时间30min90min。,四、结果观察 断电后,将玻板置于灯光下,衬以黑色背景观察。阳性者则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如沉淀线不清晰,可把琼脂板放在湿盒中37数小时或置电泳槽过夜再观察。,五、注意事项 1抗原抗体浓度的比例 当抗原抗体比例不适合时,均不能出现明显可见的沉淀线。 2适当的电渗作用在对流免疫电泳中是必要的。当琼脂质量差时,电渗作用太大,而使血清中的其它蛋白成分也泳向负极,造成非特异性反应。在某些情况,琼脂糖由于缺乏电渗作用而不能用于对流免疫电泳。 4当抗原抗体在同一介质中
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