《目的基因的获取》PPT课件.ppt

第四章 目的基因的获取,目的基因：,准备要分离、改造、扩增或表达的基因。,结构基因的组成,转录启动区,核糖体识别区,编码区,转录终止区,起译码ATG,开读框,休止码TAG、TAA、TGA,目的基因的获取方法,1、直接分离法,2、基因文库分离法,3、PCR分离法,4、化学合成法,比较各种方法获得目的基因的优缺点,第一节 直接分离法,一、限制性内切酶法,用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。,酶切,由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。,1. 优点,2. 缺点,目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！,BamH I,BamH I,BamH I,gene,适合于从简单的基因组中分离目的基因,如质粒或病毒的大小只有几千碱基,大的也超不过几十万碱基,编码基因比较少,获得也比较简单.,应用对象,1、对已定序列的DNA分子，只需要用已知识别序列的限制性内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需要的DNA片断，与适当载体连接。 2、对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的酶切识别位点，一次就可以获得。 3、即使含目的基因的DNA分子未定序或定位，也只须通过酶切分析，随后再通过部分酶切，构建一个简单的基因文库，从钩出目的基因。,二、随机片断化,1. 限制性内切酶局部消化法,控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。, 内切酶识别位点的碱基数,影响所切出的产物的长度和随机程度。,（1）限制性内切酶的选用原则,1）4bp的内切酶,平均每46（4096）bp一个切点。,2）6bp的内切酶,平均每44（256）bp一个切点。,随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。, 内切酶粘性末端,能与常用克隆位点相连。,（Sau3ABamH I）,2. 机械切割法,（1）超声波,超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。,（2）高速搅拌,1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。,三、物理化学法,基本原理：DNA分子的两条链存在着GC、AT碱基配对，其中GC间存在3个氢键、AT间存在2个氢键，如果不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等也明显不同，采用相应的方法即可达到从生物基因组中分离目的基因的目的。,密度梯度离心法,非洲爪瞻5SDNA,单链酶解法,根据其热稳定,海胆DNA,目的基因的获取方法,1、直接分离法,2、基因文库分离法,3、PCR分离法,4、化学合成法,将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。,一、基因文库的构建,1. 基因文库（gene library）,第二节 构建基因组文库分离法,（2）目前常用的载体,2. 构建基因文库的载体选用,载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。,载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。,（1）对载体的要求,载体系列： 容量为 36.451 kp cosmid载体： 容量为 45 kb YAC： 容量为 230kb-1700kb BAC: 容量为 300 kb,断点完全随机，片断长度合适于载体连接。,（1）染色体DNA大片段的制备,3. 基因文库构建的一般步骤,超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。, 物理切割法：,内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。, 酶切法：,（2）载体与基因组DNA大片段的连接, 粘性末端直接连接,载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。,如：Sau3A与BamHI的酶切末端。,直接连接、人工接头或同聚物加尾。,人工接头法（adapter）,人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。,各种酶的接头可以向公司定做或购买。,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,粘性末端, 同聚物加尾,4. 基因组文库的大小,一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。,N=,ln (1-p),ln (1-f),p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）,f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因 组DNA的百分数,N：所需的重组载体数（克隆数）,例如：人的基因组是 3109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7104 bp,N=,ln (1-p),ln (1-f),=,ln (1-99%),ln (1-f),=,4.61,G,f,N=,4.61,G,f,G：Genome大小；f：fragment大小,N=,4.61,G,f,=,4.61,3109,1.7104,= 8.1105,1. cDNA,以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。,2. cDNA library,二、 cDNA文库的构建,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。,（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。,4. 构建cDNA文库的一般步骤,（1）总RNA（total RNA）提取,3. cDNA文库的特点,提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。,分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。,利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。,（2）mRNA的分离纯化, 原理, mRNA的分离纯化,Column（柱）,反转录酶,（3）cDNA的合成, cDNA第一链合成,逆转录酶能以RNA为模板合成cDNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。,mRNA,cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,Oligo dT引物,用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA第一链,3,3,5,5,引物,cDNA第一链,3,5,引物, 降解mRNA模板,或RNaseH,碱,剩下的cDNA单链的3末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。,cDNA第一链,5,cDNA第二链合成,DNA聚合酶,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3, cDNA第二链合成,去掉发卡结构,核酸酶S1,用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,5,3,这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。,妙用RNaseH,小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。,DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。,mRNA,cDNA,3,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA第一链,3,5,引物,mRNA,cDNA第一链,3,5,mRNA,mRNA,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,cDNA第二链,cDNA第一链,3,5,RNaseH,DNA ligase,去引物,在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。,5.cDNA与载体连接：,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,6. cDNA文库的大小,一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。,N=,ln (1-p),ln (1- ),p: 文库包含了完整mRNA的概率（99%）,: 某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例,N：所需的重组载体数（克隆数）,1,n,1,n,7. cDNA文库与基因组文库相比的优越性表现在,1、 cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒，例如流感病毒；因其不通过DNA中间体，所以研究其唯一的方法就是cDNA克隆。,2、 cDNA基因文库的筛选比较简单易行。,他的文库所含的克隆数是基因文库的十分之一，或更少。,3、由于每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率比较低，而相比之下基因组文库克隆的选择较复杂，假阳性的概率就高。,4、 cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，直接应用于基因工程操作。,原因是：高等真核生物与原核生物在结构组成上的最大区别是前者含有内含子间隔序列，而后者没有。通过基因文库中筛选的目的基因难以在原核生物中表达。而cDNA是经过转录后得来的其内含子部分已被删除。,5、 cDNA克隆还可以用于真核细胞mRNA的结构和功能的研究,一种特异的mRNA在细胞中往往占很小的比例，难以直接研究其序列、结构和功能。一般是通过比较基因组进行确定,8. cDNA文库与基因组文库相比的缺点,1、受材料来源的影响,2、遗传信息量有限,3、 构建的cDNA文库中高丰度的（含量） mRNA含量比低丰度的易得和分离，其实现在构建的cDNA基本上是高丰度的而低丰度的很少,三、文库的查询（screening）,用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。,文库,载体,探针,电泳后杂交放射自显影,测序分析,目的基因的获取方法,1、直接分离法,2、基因文库分离法,3、PCR分离法,4、化学合成法,第三节 PCR扩增获得目的基因,如果知道目的基因的全序列或其两端的序列，通过合成一对与引物互补的引物，就可以十分有效的扩增出所需的目的基因。,省时,省力,1. 直接从基因组中扩增,（1）提取基因组DNA作模板,（2）根据目的基因序列设计引物,（3）PCR扩增,真核生物基因组含有内含子！,适合扩增原核生物基因。,原核基因组部分,原核细胞,提取基因组DNA,PCR扩增,（1）提取基因组 total RNA,（2）反转录合成总cDNA作模板,（4）PCR扩增,（3）根据目的基因序列设计引物,2. 从mRNA中扩增: RT-PCR,原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。,适合扩增真核生物基因。,目的基因 的引物1,反转录成目的基因cDNA第一链,目的基因 的引物2,目的 基因cDNA第二链,PCR,mRNA,值得注意的是常规PCR，可以合成的DNA片段长度有限，一般在1KB以内，大于他扩增效果显著下降。,？,未知序列的DNA,更长的DNA,特殊类型的PCR,1、套式PCR（nested PCR）,利用两对引物，从一个模板的同一区域扩增出不同长度而设计的特殊方法。他较常规PCR灵敏度大大提高，同时也能有较强的特异性。,2、不对称PCR,利用引物浓度不同（50：1或100：1）-单链DNA，用作DNA序列分析的模板。,3、反向PCR,未知序列的一种PCR方法,条件为：此未知序列的某侧序列必须已知,此外，还有锚定PCR，长程PCR，锅柄PCR，等等,目的基因的获取方法,1、直接分离法,2、基因文库分离法,3、PCR分离法,4、化学合成法,1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。,第四节 化学合成目的基因,一、目前常用的方法,磷酸二酯法、,磷酸三酯法、,亚磷酸三酯法、,固相合成法,自动化合成法。, 保护dNTP的5端P 或3端-OH, 用酸或碱的脱保护,（1）原理,1. 磷酸二酯法, 带保护的单核苷酸连接,保证合成反应的定向进行。,带5保护的单核苷酸与带3保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。,具体做法：将一个大的保护基团，如芳香磺酰氯（ArSO2Cl）或二环己基碳二亚胺（DCC）加到脱氧核苷酸的3或5羟基上。这样，具有5-保护的单核苷酸，便能够通过它的5-OP同另一个3-保护的单核苷酸的3-OH之间定向地形成一个二酯键，从而使它们缩合成两端都受保护的二核苷酸分子。,实验中使用的各种不同的保护基团，有些可以通过酸处理移去，有些可以通过碱处理移去。所以不论是5-的保护基团还是3-的保护基团，都可以通过酸或碱的脱保护作用而除掉。这样的一个带5-保护的合成的二核苷酸分子，又能够同另一个带3-保护的单核苷酸或二核苷酸进行第二次缩合反应，形成一个三核苷酸或四核苷酸分子。,原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3端磷酸和5-OH上都先连接了一个保护基团。,2. 磷酸三酯法,将第一个核苷酸的3-OH端固定在固相支持物上。,固相磷酸三酯合成法,是目前通用的合成方法。,15,合成的二核苷酸连接处有三个酯键！,固相磷酸三酯合成过程,固相支持物,结果是全保护的DNA：5 DMT, 3固相支持物, 核苷酸之间对氯苯。最后脱保护,固相 支持物,固相 支持物,C,化学合成的DNA片断一般在200bp以内。,二、 化学合成DNA片断的组装,用T4多核苷酸激酶使各个片段的5端带上磷酸。,1. 互补连接法,预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。,（2）5端磷酸化,（1）互补配对,（合成的DNA单链的5端是-OH）,T4 DNA连接酶,T4多核苷酸激酶,使5-OH磷酸化,完整的DNA双链,（3）连接酶连成完整双链,2. 互补延伸连接