Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测.doc

Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测 作者：丁睿，韩霜，雷婷，刘杰，窦科峰【摘要】 目的：扩增Id1启动子基因，构建Id1启动子的报告基因载体. 方法：通过PCR及双酶切方法，从HepG2细胞基因组DNA中获得Id1基因编码序列上游包含不同长度碱基的两段Id1启动子序列；分别克隆到报告基因pGL3enhancer载体上，构建包含两段不同长度Id1启动子的报告基因载体；用脂质体转染法将两报告基因载体分别转染至肝癌HepG2细胞系；采用双荧光素酶报告基因系统评估Id1启动子活性. 结果：经PCR方法扩增出大小分别为1096 bp和266 bp的两段不同长度的Id1启动子片段，序列测定其编码序列及读框正确，酶切鉴定亚克隆序列正确. 瞬时转染HepG2后经报告基因检测，两段启动子均具有转录活性. 结论：成功构建了Id1启动子的报告基因载体，为进一步研究Id1启动子和肝癌的关系奠定了实验基础. 【关键词】 分化抑制因子0引言Id蛋白即分化抑制或DNA结合抑制蛋白（Inhibitor of Differentiation and/or DNA binding proteins）是缺少DNA结合结构域的螺旋环螺旋（helixloophelix，HLH）蛋白，是HLH转录因子的显性负性调节分子. 已知哺乳动物Id蛋白家族有Id1Id4等4位成员. 它们可调节多种细胞进程，包括细胞生长、衰老、分化、凋亡和血管生成等1. 研究2表明Id蛋白特别是Id1，可通过灭活肿瘤抑制因子和激活生长促进通路而促进哺乳动物细胞的增殖和细胞周期的进行，其可能是肿瘤增殖所必需的关键因子. Id1可能是预测慢性肝炎肝硬化患者的肝癌发生风险的有用指标， 并且可作为治疗肝癌的靶向分子. 我们拟构建两段包含不同长度Id1启动子片段的报告基因载体， 转染HepG2细胞后检测两段Id1启动子的活性.1材料和方法1.1材料pGL3enhancer 载体，内参照pRLTK载体和Dualluciferase reporter Kit（Promega公司）；LipofectaminTM Reagent和T4 DNA连接酶（Invitrogen公司）；细胞基因组DNA提取试剂盒（Ugene公司）；高保真Taq DNA聚合酶（上海生物工程公司）；Plasmid Miniprep Kit和Gel Extration Kit（Omega公司）；DNA marker: GeneRulerTM 100 bp DNA ladder Plus和GeneRulerTM 1 Kb DNA ladder（MBI公司）； 胰蛋白胨及酵母提取物（宝泰克公司）； 限制性内切酶Hind，Kpn（大连宝生物工程公司）； 其余试剂均为国产分析纯. TD20/20荧光照度计（Turner BioSystems公司）； HepG2细胞和E.coli. JM109菌株均为本实验室保存.1.2方法1.2.1Id1启动子报告基因载体的构建引物设计自http:/dbtss.hgc.jp网站数据库检索获得Id1（GenBank/EMBL提取号码：NM002165）启动子序列的-3000+100部分序列，分别设计两段启动子引物序列，并在上游引物5端加入Kpn的酶切位点GGTACC，在下游引物5端加入Hind的酶切位点AAGCTT. 从转录起始零点开始， 两段启动子片段长度分别为:101976（1096 bp）和18976(266 bp). 上游引物分别为Fw1：gggtaccgggagcacgggaactagc和Fw2：gggtaccccacccttgctgttctga；下游引物 Rv：aagcttggagaatgggcaaagcgaaa.细胞培养及模板提取将HepG2细胞用含100 mL/L胎牛血清( FBS)的RPMI 1640培养基在37，50 mL/L CO2的孵箱中培养. 收集对数生长期细胞约1107，以细胞基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA.启动子基因的克隆以HepG2细胞基因组DNA为模板，用Fw1为上游引物、Rv为下游引物，经预实验选择94变性1 min，55退火1 min，72延伸1 min, 共30个循环，获得一长度为1096 bp的片段，命名为Id1p1；选用Fw2为上游引物、Rv为下游引物，经预实验选择94变性30 s，54退火30 s，72延伸45 s, 共30个循环，获得一长度为266 bp的片段，命名为Id1p2. 用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳获得2条鉴定条带，大小分别约为1100 bp和260 bp. 参照试剂盒的操作说明回收并纯化.Id1启动子载体的构建与测序将荧光素酶报告基因pGL3enhancer载体分别行Kpn和Hind双酶切，回收. 同时将之前回收的PCR产物同样经Kpn和Hind双酶切及琼脂糖凝胶电泳，分别回收约1100 bp和260 bp条带. 使之分别在T4连接酶的作下与pGL3enhancer载体以31和101的浓度比于16连接12 h，使Id1p1和Id1p2基因序列插入无启动子的pGL3enhancer载体中. 以低温CaCl2法转化E.coli.JM109感受态细菌，涂布于含氨苄青霉素（100 mg/L）的固体LB培养皿上，12 h后挑取单克隆菌落，以质粒小量提取试剂盒提取质粒. 行Kpn和Hind双酶切并测序鉴定阳性克隆的重组质粒. 最终构建成重组报告基因载体Id1p1/PGL3和Id1p2/PGLId1启动子载体转染肝癌HepG2细胞系将两种重组质粒、空载体pGL3enhancer和内参照pRLTK载体转化的阳性菌株，在LB培养基中37摇床培养过夜，按质粒提取说明分别提取Id1p1/pGL3，Id1p2/pGL3、空载体pGL3enhancer和pRLTK的DNA，经紫外分光光度仪测定A260 nm值. 按照LipofectaminTM Reagent脂质体转染系统说明，于转染前1日将细胞接种于24空板，5104/孔，第2日当细胞约90%融合时，每孔分别定量加入Id1p1/pGL3 (或Id1p2/pGL3) 1.0 g，PRLTK内参照载体100 ng，LipofectaminTM 5 L和无血清培养基200 L. 6 h后换含FBS 100 mL/L的RPMI 1640，培养18 h.1.2.3报告基因活性的检测瞬时转染24 h后收集、裂解细胞，离心取上清，用Dual Luciferase Reporter Assay System在TD20/20荧光照度计上测定裂解上清内Luc (Firefly Luc和Renilla Luc) 活性, 计算Firefly Luc / Renilla Luc的比值，并以空载体pGL3enhancer转染细胞作对照，进行比较以判断Id1p1和Id1p2 启动子活性.2结果2.1目的基因的克隆及测序以肝癌细胞HepG2基因组DNA为模板，分别克隆出两段Id1启动子，分别为1096 bp的Id1p1和266 bp的Id1p2（图1）.图1PCR产物琼脂糖凝胶电泳略2.2启动子报告基因载体酶切及测序鉴定回收经Kpn和Hind双酶切得到的Id1p1和Id1p2两重组质粒和pGL3enhancer载体的相应条带，经T4连接酶连接后转化E.coli.JM109感受态细菌. 再经Kpn和Hind酶切后，两种重组质粒分别释放出1096 bp和266 bp大小的片段（图2）. 测序结果亦证实两段均包含Id1启动子序列. 表明包含不同长短的Id1启动子报告基因载体构建成功.图2双酶切重组质粒琼脂糖电泳略2.3转录活性的检测两段Luc报道基因载体转染细胞均表现有Id1启动子活性，空载体pGL3enhancer对照为0.47，Id1p1为4.35（P<0.01 vs pGL3enhancer），Id1p2为2.69（P<0.01 vs pGL3enhancer），二启动子活性分别较对照升高9.26倍和5.72倍. 对结果分析表明，两段均包含核心启动子部分. 而Id1p1显示更高的启动子活性（P<0.01 vs Id1p2）.3讨论HLH转录因子具有调节细胞生长分化的重要作用，大多数HLH蛋白属于碱性的bHLH家族，具有高度保守的HLH结构域和碱性DNA结合区. Id蛋白是碱性DNA结合区缺失的bHLH蛋白，它与bHLH形成异源二聚体后即丧失结合DNA的能力，从而抑制了下游含有Ebox DNA片段的基因的转录，因而在功能上Id是这类转录因子的显性负性调节蛋白. 能与Id蛋白结合的分子可以分为两大类，包括组织普遍表达的E47和组织特异性表达的MyoD（骨骼肌）. Id与后一类分子结合能力远远强于前者，但目前发现的这类分子屈指可数.研究表明，转染外源性Id1的鼻咽癌细胞、前列腺癌细胞和卵巢癌细胞的增殖率和S期细胞所占比例升高3. 异常表达Id1的前列腺癌细胞中p16INK4a水平降低，CDK和磷酸化RB蛋白水平升高，提示Id1可能通过p16INK4a/pRB途径促进肿瘤细胞增殖4. 另一实验则表明Id1也可能通过激活MAPK途径诱导肿瘤细胞增殖5. Id1的异常过表达还可诱导乳腺癌细胞持续增殖，当下调Id1表达时可导致细胞周期素cyclinD1和cyclinE的表达下降和cyclinECdk2活性降低，以及pRB的Ser780位点的磷酸化程度降低，这与下调cmyc蛋白表达的作用效果类似，提示Id1也可能参与cyclinD对cmyc蛋白表达依赖途径从而促进细胞周期进程，诱导肿瘤细胞增殖6. 而当阻断Id1，Id2和Id3蛋白表达时，人结肠腺癌S期细胞比率降低，且与阻断量负相关7. 此外，研究发现，Id1和Id2在高度侵袭性前列腺癌细胞PC3中高表达，而在非侵袭性的LNCaP细胞中低表达，且阻断Id2表达后，可使肿瘤细胞侵袭和增殖能力降低8. 在上皮性卵巢肿瘤中，Id1的表达程度与肿瘤低分化和高侵袭特性相关，高表达的Id1可提示不良预后相关9. 以上均提示Id蛋白与肿瘤增殖、侵袭和转移能力密切相关.目前Id蛋白与肝癌相关性的研究仍鲜有报道. 初步发现高表达的Id1可能是预测慢性肝炎肝硬化患者的肝癌发生风险有价值的指标10. 通过组织微阵列研究表明Id1的表达与VEGF表达显著相关，它可通过稳定化处理HIF1 alpha（缺氧诱导因子1alpha）蛋白而介导VEGF的转录活性. 下调VEGF可抑制Id1从而延缓肿瘤细胞侵袭11. 我们成功构建了Id1两段不同长度的启动子载体并顺利转染肝癌HepG2细胞系，使受控于Id1启动子的Luc报道基因在HepG2细胞中得到瞬时表达. 24 h后测定细胞内Luc活性的结果提示，两个启动子片段与空载体相比均显示出较高的活性，提示此DNA区域(189 bp76 bp) 为Id1启动子的核心部位;而其中Id1p1片段启动子活性更高，提示此DNA区域(1019 bp189 bp)可能存在某些转录因子的正性调控元件. 而哪些转录因子可以结合到这部分区域并发挥调控作用还有待于进一步研究. 我们的实验结果为将来进一步研究可作用于Id1启动子的相关因子及研究Id1在肝癌发生发展过程中的作用及机制奠定了实验基础.【参考文献】 1 Sikder HA, Devlin MK, Dunlap S, et al. Id proteins in cell growth and tumorigenesisJ. Cancer Cell, 2003, 3(6):525-530.2 Wong YC, Wang X, Ling MT. Id1 expression and cell survivalJ. Apoptosis, 2004, 9(3):279-289.3 Langlands K, Down GA, Kealey T. Id proteins are dynamically expressed in normal epidermis and dysregulated in squamous cell carcinomaJ. Cancer Res, 2000， 60(21):5929-5933.4 Ouyang XS, Wang X, Ling MT, et al. Id1 stimulates serum independent prostate cancer cell proliferation through inactivation of p16(INK4a)/pRB pathwayJ. Carcinogenesis, 2002, 23(5):721-725.5 Ling MT, Wang X, Ouyang XS, et al. Activation of MAPK signaling pathway is essential for Id1 induced serum independent prostate cancer cell growthJ. Oncogene, 2002, 21(55):8498-8505.6 Swarbrick A, Akerfeldt MC, Lee CS, et al. Regulation of cyclin expression and cell cycle progression in breast epithelial cells by the helixloophelix protein Id1J. Oncogene, 2005,24(3):381-389.7 Wilson JW, Deed RW, Inoue T, et al. Expression of Id helixloophelix proteins in colorectal adenocarcinoma correlates with p53 expression and mitotic indexJ. Cancer Res, 2001, 61(24):8803-8810.8 Coppe JP, Itahana Y, Moore DH, et al. Id1 and Id2 proteins as molecular markers for human prostate cancer progressionJ. Clin Cancer Res, 2004, 10(6):2044-2051.9 Schindl M, Schoppmann SF, Strobel T, et al. Le