乙型肝炎病毒基本核心启动子突变定量检测和对慢性乙肝人群的健康管理意义.doc

乙型肝炎病毒基本核心启动子突变定量检测和对慢性乙肝人群的健康管理意义江伟俊1 张圆海2 邢茂迎3 满晓波3 1上海市同仁医院消化内科 上海市 2004382江苏省镇江市第三人民医院传染科 镇江市2120033第二军医大学附属东方肝胆外科医院门诊部 上海市 200438目的：检测未发生肝癌的乙肝病人、发生肝癌的乙肝病人的血清和肝脏组织中乙肝病毒BCP区双突变，探讨检测此突变对于乙肝病人发生肝癌的健康管理和预防指导的意义。方法：采用一种新的基于引物探针特异性的定量PCR方法进行准确的突变检测。结果：克隆了HBV的BCP区1762（A-T）/1764（G-A）双突变相关的野生型质粒、1762单独突变型质粒、1764单独突变型质粒和1762/1764双突变质粒。检测发现未发生肝癌的慢性乙肝病人的血清突变率为50%，肝癌病人突变率为77%，两组比较有统计学差异，p=0.0184。肝癌病人的肝脏组织中突变率为64.70%。结论：发生肝癌的乙肝患者的HBV的BCP区双突变发生率明显高于未发生肝癌的乙肝患者，此突变和乙肝发展为肝癌正相关，检测此突变可以对乙肝患者的健康管理提供指导。 通信作者：满晓波，第二军医大学附属东方肝胆外科医院门诊部 上海市 200438基金项目：上海市卫生局科研课题乙肝病毒BCP区双突变对核苷类药物耐药突变影响的临床研究，编号2008081Quantitative detection of basic core promoter mutants of Hepatitis B virus in hepatitis B and hepatocellular carcinoma patients Jiang Wei-Jun 1, Zhang Yuan-Hai 2, Xing Mao-Ying 3, Man Xiao-Bo 3 *1 Department of Gastroenterology, TongRen hospital, Shanghai, 2000002 Department of Infectious Disease, The Third hospital of Zhenjiang, zhenjiang City, 2000003 Department of Outpatient, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Shanghai, 200438Corresponding to: Man Xiao-Bo, Department of Outpatient, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Shanghai, 200438Objective: Detection of basic core promoter (BCP) mutants of Hepatitis B virus (HBV) in hepatitis B patients with or without hepatocellular carcinoma. Method: Using a new method of real time PCR based on specific primer. Result: Different BCP mutant plasmids were cloned including of wild type, 1762 mutant, 1764 mutant and 1762/1764 double mutant. BCP mutation was detected in 50% of chronic hepatitis B patients without HCC while in 77% with HCC (p=0.0184). BCP mutation was 65% in liver tissue specimen of HCC patients with HBV infection. Conclusion: BCP mutation was happened significant more in HBV patients with HCC than that in HBV patients without HCC indicating that BCP mutation was correlation with HCC development in HBV patients. 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是在中国常见的疾病1，HBV不仅可以引起急性肝炎和慢性肝炎，进一步发展成为肝硬化、原发性肝癌和终末期肝功能衰竭2-4。 鉴于中国的原发性肝癌和肝硬化主要是由乙型肝炎发展而来，就慢性肝炎和乙肝携带者而言，其最终的危害在于肝硬化和肝癌的发生，所以预测乙肝病人发生肝硬化和肝癌是乙肝病人健康管理的重要内容。变异是生物适应环境生存的重要方式，HBV有较高的变异性5-7， HBV复制是通过RNA中间体利用病毒本身的DNA聚合酶反转录成负链DNA， DNA聚合酶缺乏校对酶活性不能修正核苷酸错配。HBV最常见和最具有临床意义的突变包括核苷类药物耐药突变(例如拉米夫定耐药突变和阿德福韦耐药突变)8、1896突变9和基本核酸启动子（Basic Core Promotor，BCP）区1762（A-T）/1764（G-A）双突变10-15。乙肝病毒BCP区变异和乙肝病毒的致病性密切相关10，尤其是和乙肝病毒最重要的临床意义相关，研究较多的是BCP区的1762/1764双突变11-15，同重症肝炎、肝硬化和肝癌的发生密切相关，在乙肝病人最终发生肝癌的病人中BCP区双突变的发生率明显升高，而对一些发生BCP区双突变的乙肝病人或者携带者的追踪研究发现也有肝癌发生升高的趋势，这一热点BCP区1762/1764双突变可能同肝癌的发生密切相关，对于乙肝病毒感染病人进行检测此突变，应该更加注意发生突变的人群的健康管理，为不同的人群进行分类和分层健康管理和指导开拓了新的领域，这部分人群组要比没有野生型的人群加强随访，缩短预防体检间隔，有助于合理健康管理和干预肝癌发生。本研究首先克隆了BCP区1762/1764双突变相关的野生型质粒、1762单独突变型质粒、1764单独突变型质粒和1762/1764双突变质粒，检测未发生肝癌的乙肝病人、发生肝癌的乙肝病人BCP区双突变，并且采用一种新的基于引物探针特异性的定量PCR方法进行准确的突变检测。一、材料和方法1 检测标本收集2004年-2006年在第二军医大学东方肝胆外科医院、上海市同仁医院和江苏省镇江市第三人民医院的部分慢性乙型肝炎和同时患有肝癌的乙型肝炎血清和部分手术切除标本组织。2 主要试剂标本DNA提取裂解液: Tris平衡酚、氯仿、异戊醇(25：24：1)混合液、辛酸钠。荧光定量PCR相关试剂：10Buffer for Taq、dNTPs（10mM each）、MgCl2（250mM）、primer（10M）、TaqMan probe（5M）、Taq DNA聚合酶（5U/l）。3 主要仪器PCR仪(PERKIN ELMER PCR system)，iCycler实时荧光定量PCR仪（美国BioRad公司）4 方法4.1. 血液乙肝病毒DNA提取抗凝或非抗凝血短暂离心，吸取上层血清或血浆100ml，加入2%辛酸钠水溶液50ml，混匀离心，100水浴15分钟，18000g离心15分钟，吸上清入待用。4.2 标准品质粒克隆克隆引物：F：5 GGC CTC AGT CCG TTT CTC GCC CCC AAT ACC ACA TCA T GGC CTC AGT CCG TTT CTC GCC CCC AAT ACC ACA TCA T TTGTTCAGTGGTTCGTAGGGC 3 TAMRA4.5 定量PCR样品设置：每一批次的定量PCR反应包括：样品DNA提取液、定量标准品（107-103共5孔）、已知强阳性对照、已知弱阳性对照及阴性对照。4.6 定量PCR体系：10Taq Buffer5mlMgCl2(25mM)5mldNTPs(10mM each)1mlF/R引物（20mM）各1mlTaqMan Probe（20mM）1mlTaq DNA聚合酶（5U/ml）0.5mlHBV DNA提取液或系列稀释的质粒标准品1ml去离子水至50ml4.7 定量PCR程序： 95 3分钟9530秒6030秒507230秒荧光采集点为72延伸段的最后10%4.8 结果判断：定量PCR完成后，设定为背景扣除模式。先检查阴性、阳性结果是否正常。若正常，检查标准品Ct值相关性是否正常。若正常，检查阳性对照的定量值是否在标准范围内。若正常，最后计算样品中HBV DNA的浓度。5. 乙肝病毒DNA 1762/1764位突变检测5. 1 对照质粒克隆：取一位乙肝病毒阳性患者HBV DNA提取液， PCR法克隆包含乙肝病毒1762/1764位的片段。PCR体系除引物和模板之外同上，PCR结束连接入T-载体，克隆测序，质粒抽提，测定浓度。5. 2.乙肝病毒DNA 1762/1764突变检测对照质粒的稀释先根据对照质粒的浓度稀释至1mg/ml，再稀释50000倍，即20pg/ml。5. 3.定量PCR样品设置每一批次的定量PCR反应包括样品DNA提取液、野生型对照质粒、突变型对照质粒及阴性对照。每个上述样品各以野生和突变引物-探针组进行PCR检测。5.4 定量PCR和结果判断：定量PCR体系除引物不同之外同上，定量PCR完成后，设定为背景扣除模式。先检查阴性对照的结果是否正常，若正常，检查野生及突变对照质粒的Ct值是否正常，最后判断样品中HBV DNA1762/1764位的类型，野生或突变或双突变。二、结 果1、HBV 突变质粒克隆和鉴定克隆了HBV的BCP区1762（A-T）/1764（G-A）双突变相关的野生型质粒、1762单独突变型质粒、1764单独突变型质粒和1762/1764双突变质粒，采用引物序列的定点突变，1762/1764双突变质粒的最初序列的克隆采用两次定点突变。利用标准品血清同步实验的方法进行病人乙肝病毒突变检测,以适当浓度的野生株和突变株质粒混入正常血清中，与待检测的血清平行处理，以避免因为血清制备造成的误差。2、定量PCR检测突变和野生质粒标准品结果以适当浓度的质粒为模板进行定量PCR检测，分别为BCP区1762/1764野生型，BCP区1762/1764双突变和BCP区1762和1764各自单突变。各种基因型的反应体系分别为primer-W、primer-M、primer-O1和primer-O2，分别代表相应位点的野生、突变、备选对照1和备选对照2。涉及同向反应体系则分别使用primer-WW、primer-WM、primer-WO1和primer-WO2，以及primer-MW、primer-MM、primer-MO1和primer-MO2图1、 BCP区1762野生型质粒混合于血清，相同处理制备作为模板，野生反应体系和突变反应体系之间的的Ct值至少差15个循环，即32000倍。图2、 BCP区1762突变质粒混合与血清，相同处理制备作为模板，突变反应体系和野生反应体系之间的的Ct值至少差13个循环，即8000倍。图3、病例血清，相同处理制备作为模板，BCP区176217反应体系反应检测，突变反应体系和野生反应体系之间的的Ct值差3个循环，即8倍。YIDD突变，合并部分野生型病毒（15）。3、肝炎病人和肝癌病人血清中BCP1762/1764双突变检测结果我们检测了尚未发生肝癌的慢性乙型肝炎病人中的BCP区1762/1764双突变，结果发现，在没有发生肝癌的慢性乙肝病人（50例）的HBVDNA阳性血清中BCP区1762突变率为50%（25例），即一半的病人存在BCP区1762/1764双突变，而在已经发生肝癌的慢性乙肝病人（30例）的HBVDNA血清中BCP区1762突变率为77%（突变有23例），高于没有发生肝癌的慢性乙肝病人的HBVDNA阳性血清中BCP区1762突变率。应用SAS处理软件进行卡方检验分析，两组比较有统计学差异，肝癌组中的突变比例大于肝炎组。卡方值为5.5556，p=0.0184。同时我们检测了34例患有乙型肝炎的肝癌病人的外科手术切除的标本中BCP区1762/1764双突变情况，发生完全野生型的有12例，完全突变型的有19例，混合型突变的3例，突变率为64.70%。图4、 未发生肝癌的乙型肝炎病人和患有乙型肝炎的肝癌病人中发生BCP区1762突变的比例图5、 患有乙型肝炎的肝癌病人手术标本中发生BCP区1762突变的人数，其中W代表完全野生型，M代表完全突变型，W/M代表野生型和突变型的混合。图6、 患有乙型肝炎的肝癌病人手术标本中发生BCP区1762突变的人数，其中W代表完全野生型，M代表出现突变。三 讨论检测乙肝病毒突变则可以检测乙肝病毒的性质、耐药与否、致病能力和遗传特征，传统的PCR-SSCP法对检测的位点有特别要求，对于单拷贝序列的直接测序是准确的方法，但是测序会有误差，其次克隆过程中会有PCR的错配，直接测序或者经过克隆的步骤，或者通过PCR产物测序，但是不准确并且不能分辩病毒野生株和突变株并存。基因克隆过程本身操作复杂，测序仪很难标准配置。目前的检测方法除了传统的方法和直接测序之外，在现代分子生物学的基础上发展除了很多新的更加准确的和高通量的检测方法，例如基于高通量的基因芯片方法和基于定量PCR的熔点曲线等方法16，其它的方法还包括SOMA质谱法、毛细管电泳和pyrosequence方法等，但是这些方法分别存在操作复杂、结果准确性不高和成本较高等缺点。由于上述原因，开发一种准确快速操作方便和价格低廉的乙肝病毒点突变监测方法具有重要的临床意义，基于引物特异性扩增PCR方法结合实时荧光定量PCR方法，我们开发出了一种准确快速简便并且定量分析突变比例的乙肝病毒点突变检测方法，可以准确地验证对乙肝病毒常见的拉米夫定和阿德福韦耐药位点和BCP双突变位点的检测，结果显示，我们的方法可以定性检测的同时进行突变株的定量检测，对于突变的检测可以准确地检测突变株乙肝病毒的存在，同时可以定量分析突变株和野生株的比例，在足够多的阳性对照和标准品对照的情况下可以准确地进行野生株和突变株的绝对定量，从而能够在早期提供乙肝病毒突变的情况，为尽早改变乙肝病毒治疗方案和临床干预提供证据，同时本方法快速方便，其速度决定于PCR的速度，一般不超过2小时，操作简单，只要进行常规的实时荧光定量PCR过程即可，对于操作人员人员要求低，能够进行定量PCR的实验人员即可掌握，同时对仪器设备要求低，只要配备实时荧光定量PCR仪即可。利用第一部分克隆的BCP区1762/1764双突变的野生株和突变株质粒，检测了未发生肝癌的慢性乙型肝炎病人血清中的HBVDNA阳性的BCP区1762/1764双突变，实验中发现1762突变和1764突变总是伴随，所以在后来的标本检测中均可以只进行1762突变检测代替BCP双突变检测。BCP区的1762/1764双突变检测是非常有临床意义的乙肝病毒突变位点，这一位点的重要性在于它甚至可以做为预测乙肝临床转归尤其是肝硬化和原发性肝癌的危险预测因子。乙型肝炎的主要问题就是慢性肝炎患者和携带着最终发展到肝硬化和肝癌，所以监测和治疗乙肝的主要目的是延缓和阻止终末期肝硬化和肝癌的发生发展。研究发现肝炎病毒的基因型和变异同预后和治疗密切相关17，其中BCP的变异是多位点和复杂的18， BCP区是富含AT区域，具有肝脏富含因子的转录结合点，变异的BCP可改变这种结合，降低前C的RNA转录，最终使HbeAg表达减少，BCP的变异还可前基因组RNA转录增强，病毒包装有很大增强19。BCP区的1762/1764双突变同很多肝炎引起的肝脏疾病相关，例如重症肝炎、肝硬化和肝细胞癌，具有重要的临床意义，如果发生BCP区的1762/1764双突变，则意味着发生肝硬化和肝癌的可能性增大20，对这样的病人应该更加密切的注意肝炎的治疗和并发症的监测，应该更加密集地进行肝癌和肝硬化的体格检查，例如B超、CT和甲胎蛋白等检查。研究BCP区1762/1764双突变引起肝癌有助于对已经发生突变病人如何预防和以及通过合理干预的方式防止肝癌的发生。结果发现，在没有发生肝癌的慢性乙肝病人的HBVDNA阳性血清中BCP区1762突变率为50%，即一半的病人存在BCP区1762/1764双突变，而在已经发生肝癌的慢性乙肝病人的HBVDNA血清中BCP区1762突变率为77%，高于没有发生肝癌的慢性乙肝病人的HBVDNA阳性血清中BCP区1762突变率。经统计处理后，发现发生肝癌的慢性乙肝病人组与慢性乙肝病人无肝癌发生组BCP区1762突变率差异具有统计学意义。同时检测了肝癌病人的手术切除标本中BCP区1762/1764双突变，发现突变率为65%。检测已经发生肝癌的慢性乙型肝炎病人中的BCP区1762/1764双突变是回顾性和开放性的初步研究，如果进行前瞻性结果应该更好，另外肝炎病人和肝癌病人的外周血中病毒载量和肝脏中存在的HBV并不一致，目前的数据只是说明两种病人中乙肝病毒复制的情况下突变和野生病毒的比例。在一些情况下病毒并不复制所以外周血不能检测病毒，如果外周血没有检测到病毒，不能通过外周血情病毒检测来测量病毒总量和病毒突变情况，但是肝脏中是依旧存在病毒的，这就需要检测肝脏组织中的病毒突变情况，才能正确反映突变和疾病发生的关系。由此可见在肝炎病毒中的确存在相当高的病毒的BCP区1762/1764双突变实际上是一种较为普遍的现象，事实上有很大的可能是一种多态性，并且和疾病密切相关，尤其是和原发性肝癌的关系，本研究的结果证实了在已经发生肝癌的病人中BCP区1762/1764双突变发生率高于没有发生肝癌的乙肝病人，提示BCP区1762/1764双突变和肝癌的发生密切相关。这一检查的重要的临床意义在于可以预测肝癌的发生。因为是回顾性开放性的初步研究，所以如果进行前瞻性结果应该更好，另外肝炎病人和肝癌病人的外周血中病毒载量和肝脏中存在的HBV并不是一致。健康管理学是通过对个人的健康状况以及影响健康的风险因素进行全面检查和监测，收集多方面的信息，掌握影响健康的生理、心理及行为风险因素的现状，进行分析评估，提供咨询和进行行为干预。通过乙肝病毒基因突变检测，对慢性乙肝感染人群群进行分析、统计，在一定程度上预测乙肝相关疾病发生的风险性及发展的趋势和规律，可以以此改进预防的策略。对乙肝病毒致病相关性突变的检测有助于肝炎病人的健康管理，提高病人的生存质量，能够早期发现和诊断乙肝引起的肝癌，有助于肝癌的早期根治性治疗。参考文献1. 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