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文档简介

,课 程 设 计 思 路,突变:易错PCR pETBlue-2 纯化：Ni2+螯合层析 荧光光谱仪 双光束紫外分光光度计,碱性磷酸酶的定点突变,反应体系 ddH2O X uL 2.5mmol/L dNTP 4uL 10xbuffer Mg2+Free 5uL 引物 （10umol/L） 2uL/each 模板DNA 1uL ExTaq E 0.3uL（1.5U）,Mg2+（mM） 2，3，4，5，6，7 Mn2+（mM） 0，0.05，0.10，0.15，0.20,（94 ,1 55 ,1 72 ,2）30个循环, 72 ,10,0.8%琼脂糖凝胶 1xTAE,PCR产物的回收(博大PCR产物快速胶回收试剂盒） 1. 切胶、称胶重,每100mg胶加入700uL溶胶液，550C溶胶(一定要完全溶解)。 2. 装柱，12000rpm离心30秒，去除废液。 3. 漂洗:500uL漂洗液，12000rpm,30秒漂洗一次，去除废液,重复漂洗一次。 4. 12000rpm,2分钟，换成干净的无菌1.5mL小管。 5. 向柱子的正中央加20uL洗脱buffer或无菌水，放置5分钟。 6. 12000rpm,30秒。 7.向柱子的正中央加10uL洗脱buffer或无菌水，放置5分钟。 8. 12000rpm,2分钟。 9. SYBR检测回收产物,质粒DNA的提取 接含pETBlue-2(质粒的单菌落于4mL LB 羧苄（50ug/mL ）和四环素（12.5ug/mL）液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜 4000rpm、离心1min，收集所有菌体 150uL溶液I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀!），室温静置菌液裂解变清, 加入200uL溶液III（轻轻混匀!），冰上静置15min质粒DNA复性 12000rpm，离心10min 上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（旋涡混匀） 12000rpm，离心5min 上清加等体积的氯仿：异戊醇（旋涡混匀） 12000rpm，离心5min ,上清加2倍体积的无水乙醇（旋涡混匀），室温 30min 12000rpm，离心10min 沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心） 12000rpm，离心5min 沉淀于超净台中风干 沉淀加入20uL RTE，600C水浴30分钟溶解 -200C保存,370C酶解3小时 酶切产物的纯化和回收(博大PCR产物快速胶回收试剂盒） 每100uL溶液加入700uL溶胶液，其余的操作步骤同前。 向柱子的正中央加20uL洗脱buffer，其余的操
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