RAPD技术在玉兰亚属植物分类研究中应用.doc

RAPD技术在玉兰亚属植物分类研究中的应用*基金项目：深圳市仙湖植物园科研基金资助。作者简介：王亚玲（1971），女（汉族），助研，西北农林科技大学在职硕士研究生。王亚玲1,2，张寿洲3，崔铁成2 （1 西北农林科技大学，陕西杨陵712100；2 西安植物园，西安710061；3仙湖植物园，深圳518004）摘要：对玉兰亚属的17个种进行RAPD标记实验的结果表明：RAPD标记在玉兰亚属内具有很高的多态性，证明RAPD标记可作为木兰科低等级分类单元的分类依据。聚类分析结果显示，分布于美洲的渐叶木兰与其它分布于亚洲的种类明显分开，滇藏木兰与亚洲的其余15个种也具有较远的亲缘关系，其余各个种各自聚类，种间均有着不同的遗传距离。RAPD及分子序列测定分析结果均不支持玉兰亚属以萼片状花被片、开花时间、花被片颜色作为分组的依据，建议玉兰亚属以地理分布特征作为分组依据，建立亚洲组与美洲组两个类群。关键词：玉兰亚属；RAPD标记；分类Studies on Classification of Subgenus Yulania by RAPD AnalysisWang Yaling1,2,Zhang Shouzhou3,Cui Tiecheng2 (1 Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry ,Yangling,Shanxi 712100; 2 Xian Botanical Garden,Xian 710061;3 Shenzhen Fairy Lake Botanical Garden,Shenzhen 518004)Abstract Seventeen species were tested by RAPD analysis. The results indicated that RAPD patterns within Subgenus Yulania were highly polymorphic, which could be used for the classification of Magnoliaceae at the level of species. M.acuminata originating from North America could be obviously distinguished from the other species from Asia by the cluster analysis. Of the Asia species, the relationships between M.campbellii and the other Asia species were poor. The rest Asia species were clustered into different groups respectively and there were different distance between any two species. The results from RAPD and sequence analysis did not support sectional treatments of the Subgenus Yulania based on sepaloid tepals, time of flowering, and the tepal color. It was suggested that Subgenus Yulania could be divided into two sections: section Asia and section America.Key words：Subgenus Yulania；RAPD analysis；classification木兰属玉兰亚属(Magnolia subgenus Yulania)植物为落叶乔木或灌木，栽培历史悠久，有许多著名的园林观赏和药用种类。由于该亚属分布范围广，自然杂交容易，形态变异类型多，为该属的分类造成一定的困难。随着分子生物学的发展， RFLP、RAPD、cpDNA基因序列测定等分子生物学手段在植物系统学研究中越来越受到重视。RFLP 及matK、trnK间隔区、psbA-trnH、atpB-rbcL、ndhF、trnL、trnL-trnF等cpDNA序列的测定分析也已在木兰科（Magnoliaceae）植物分子系统学研究中得到应用，在验证了许多解剖学、形态学观点的同时，也提出许多与形态学分类很不相同的系统发育树，对一些传统的分类依据提出了质疑1-4。但由于木兰科植物具有原始保守性，cpDNA序列在本科中进化很慢，碱基变异位点相对其它被子植物变化要少的多，所能提供的信息量较少，使cpDNA序列分析在木兰科系统研究中的应用受到限制。RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）是一种运用随机引物扩增整个基因组，来寻找多态性DNA片段作为分子标记的技术，是一种多态性极高的分子标记手段，被广泛应用于遗传多样性、分子辅助育种、种间或属间遗传关系、品种的分类鉴定、基因定位与分离、构建遗传图谱等方面的研究。RAPD技术在木兰科植物的研究上应用不多，遗传多样性方面的研究仅见于观光木属（Tsoongiodendron）、鹅掌楸属（Liriodendron）5-6。系统发育研究方面仅应用于含笑亚族（Trib. Michelieae）的系统分析，并得出了与cpDNA序列测定分析基本一致的结果7。本研究目的在于借助RAPD技术来检测玉兰亚属种间的亲缘关系，对经典的形态学分类及现代cpDNA序列分析结果进行验证。1 材料与方法1.1 材料 包括玉兰亚属15个种和新发表的2个种，种名及来源见表1。 表1 本研究所用的材料及其来源 Table 1 The samples and their sources in this study 编号中 文 名拉丁名来 源编号中 文 名拉丁名来源1白 玉 兰M.denudata华南植物园10日本辛夷M.kobus华南植物园2天目木兰M.amoena华南植物园11星花玉兰M.stellata仙湖植物园3滇藏木兰M.campbellii华南植物园12柳叶木兰M.salicifolia昆明植物园4凹叶木兰M.sargentiana华南植物园13渐叶木兰M.acuminata华南植物园5武当木兰M.sprengeri华南植物园14辛 夷M.liliiflora华南植物园6湖北白玉兰M.elongata华南植物园15景宁木兰M.sinostellata仙湖植物园7宝华玉兰M.zenii华南植物园16伏牛山木兰M.funiushanensis仙湖植物园8望春玉兰M.biondii仙湖植物园17二乔玉兰M.soulangeana仙湖植物园9黄山木兰M.cylindrica华南植物园181.2 DNA提取 选用新鲜幼嫩的叶片或硅胶快速干燥保存的叶片作为材料，采用改进的CTAB法提取DNA8。每个种采2个个体，分别提取DNA后，等量混匀，用DNA估算DNA的浓度，并将模板稀释至20-40ng用于RAPD-PCR反应。1.3 引物的筛选 从SBS赛百威的A字号和上海生工的S字号共55个引物中筛选出多态性好、条带亮、清晰无弥散的引物15条（表2），对所有的样品进行PCR扩增。编号No. 序列Sequences A1 CAGGCCCTTCS4 GGACTGGAGTS5 TGCGCCCTTCS21 CAGGCCCTTCS41 ACCGCGAAGGS43 GTCGCCGTCA S61 TTCGAGCCAG S65 GATGACCGCCS101 GGTCGGAGAA S104 GGAAGTCGCC S105 AGTCGTCCCC S121 ACGGATCCTG S123 CCTGATCACC S125 CCGAATTCCC1.4 DNA扩增条件 扩增反应在eppendorf梯度PCR扩增仪上进行，反应体系为25l，包括DNA 20-40ng，引物10pmol，dNTP 0.1mmol/L，10xBuffer2.5l,TaqDNA聚合酶1U。扩增程序为：94，350”94,35”36，172，245个循环72，7。扩增产物加入6x溴酚蓝3l，在含 表2 本研究所用的引物序列 0.5%EB（溴乙锭）的1.5%的琼脂糖凝胶中，用 Table2 The sequence primers of which used 1x TAB缓冲液、以3.7v/cm的电压电泳2小时30分钟后，将凝胶置于SYNGENE凝胶成像系统中照相。1.5 谱带的统计分析 电泳图谱中的每一条带（DNA片段）作为一个分子标记。根据各分子标记的迁移率及其有无计算所有位点的二元数据：显带 记为“1”，无带记为“0”。记带的原则为：只记录易于辨认的条带，排除模糊不清的带；在所要比较的泳道中无法准确标识的带予以排除；对于迁移率相同，但强度不同的带，当强带的强度超过弱带的2倍时，弱带记为“0”；与对照反应产物具有相同的迁移率的带不记。人工记数后，计算多态位点百分率P，P=多态位点/位点总数。数据用MEGA2.1软件，以p-distance方法计算距离系数（表3），得到UPGMA（unweighted pair group method using arithmetic average）聚类图（图2）。图1 引物S4对17个供试材料的扩增图谱（材料编号种名见表1）Fig.1 The PCR-map of 17 species（The No. and name of species seeTable1）2 结果 用筛选的15条引物对所有样品进行PCR扩增，共扩增出274条带，扩增带最多的引物是S121（25条带），最少的是S23（10条带），平均每个引物产生18.3条带，片段长度多集中在300-1200bp（图1）。渐叶木兰、滇藏木兰、柳叶木兰等9个种具特异性带37个，占总带数的13.5%，其中这三个种的特异性带数最多，分别为11、8、9个。单态位点仅12个，多态性位点百分率高达95.6%，产生的多态性带数与所用引物数的比例为17.6。根据邹喻苹等（2001）的统计数据，在已进行过的种间系统关系研究中，平均所用引物数为14.2，多态位点百分率为87.7%，多态性带与所用引物数的比例为13.4，比较而言，玉兰亚属的RAPD结果显示了较高的多态性9。 通过计算距离系数建立的距离距阵中，距离最近的两个种为白玉兰和宝华玉兰，为0.092，最远的为滇藏木兰与伏牛山玉兰，为0.892。表3 玉兰亚属各种的距离系数距阵Table3 The matrix of distance coefficient between species based on 274 RAPD bandsOTU 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 0.0002 0.430 0.0003 0.438 0.697 0.0004 0.251 0.568 0.421 0.0005 0.183 0.568 0.421 0.152 0.0006 0.263 0.546 0.405 0.227 0.173 0.0007 0.092 0.475 0.413 0.245 0.210 0.210 0.0008 0.343 0.168 0.743 0.475 0.438 0.438 0.396 0.0009 0.157 0.373 0.413 0.221 0.245 0.257 0.162 0.322 0.00010 0.430 0.194 0.759 0.641 0.591 0.591 0.456 0.233 0.475 0.00011 0.263 0.546 0.456 0.251 0.216 0.358 0.322 0.388 0.295 0.465 0.00012 0.405 0.524 0.557 0.456 0.456 0.456 0.430 0.475 0.396 0.465 0.456 0.00013 0.568 0.682 0.668 0.524 0.504 0.568 0.712 0.727 0.494 0.851 0.465 0.794 0.00014 0.257 0.263 0.546 0.308 0.322 0.295 0.263 0.308 0.263 0.373 0.381 0.322 0.628 0.00015 0.381 0.405 0.668 0.430 0.336 0.365 0.405 0.308 0.405 0.373 0.350 0.591 0.682 0.358 0.00016 0.358 0.365 0.892 0.405 0.388 0.388 0.381 0.205 0.430 0.269 0.373 0.535 0.727 0.336 0.365 0.00017 0.162 0.413 0.388 0.194 0.173 0.251 0.168 0.405 0.199 0.430 0.263 0.358 0.504 0.233 0.381 0.405 0.000 M.denudata M.zenii 1 M.cylindrical M.soulangeana 2 M.elongata M.sargentiana M.sprengeri 亚 3 M.liliiflora 洲 4 M.stellata 种 B M.salicifolia M.sinostellata M.funiushanensis M.kobus A M.amoena M.biondii M.campbellii M.acuminata 美洲种 0.15 0.10 0.05 0.00 图2 玉兰亚属17个种的RAPD的UPGMA聚类树状图 Fig.2 The UPGMA dendrogram based on RAPD bands 在UPGMA聚类图（图2）中，渐叶木兰与其它分布于亚洲的16个种成为姊妹类群，形成第一级分支。分支A中，滇藏木兰又与其它亚洲种形成姊妹类群。分支B中，亚洲种在结合线0.11处形成4分支，其中分支由白玉兰组（Sect.Yulania）中的6个种（白玉兰、宝华玉兰、二乔玉兰、湖北白玉兰、凹叶木兰、武当木兰）、望春玉兰组（Sect.Buergeria）中的2个种（黄山木兰和星花木兰）和紫玉兰组（Sect.Tulipastrum）的1个种（紫玉兰）组成。其中白玉兰、宝华玉兰、二乔玉兰、黄山木兰亲缘关系较近，湖北白玉兰、凹叶木兰、武当木兰亲缘关系最近。分支由望春组的日本辛夷、望春玉兰、玉兰组的天目木兰及伏牛山玉兰组成。柳叶木兰与景宁木兰与这两支分别为并系种类，成为分支和。3 分析与讨论 Dorothy J.Callaway在The World of Magnolias、刘玉壶在中国植物志（第三十卷第一分册）、陈宝梁等在Notes on MagnoliaceaeIII. Magnoliaceae China中，根据花部的特征将玉兰亚属的种类分为3个组：（1）玉兰组Sect.Yulania (Spach) Dandy落叶乔木或灌木，先叶开花，花被片近似，白色、玫瑰色或紫红色。包括白玉兰等种和变种11个；（2）望春玉兰组Sect.Buergeria (Sieb.et Zucc.) Dandy 落叶乔木或灌木，先叶开花，外轮花被片萼片状，花红色或紫红色。包括望春玉兰等种和变种6个；（3）木兰组Sect.Tulipastrum (Spach) Dandy落叶乔木或灌木先叶开花或花叶同时开放，外轮花被片萼片状，花紫色或黄绿色。包括辛夷和渐叶木兰种和变种3个 10-12。但RAPD的聚类结果不支持该分组处理。作为玉兰亚属分布于美洲唯一的种，渐叶木兰与其余分布于亚洲的16个种成为姊妹类群，显示较远的亲缘关系。这与分子序列测定的结果（trnK、RFLP、ndhF）一致1-4。在经典分类系统中，该种与紫玉兰作为一组，它们同具萼片状外轮花被片，花叶同放或后叶开花。然而，RAPD结果显示二者的亲缘关系很远，距离系数为0.628。相对分布于亚洲的类群，渐叶木兰具有较为进化的特征：花小，萼片狭窄，且是唯一花瓣黄绿色的种。故推测渐叶木兰发源于中国温带地区，后经地理迁移到美洲，经长期地理隔离而形成现在的类型，但该种与分布于亚洲的各个种不具生殖隔离。分支A中，滇藏木兰与其它亚洲种成为姊妹类群，这与形态学分组及分子序列分析的结果均不一致。在依据分子序列分析所建立的树形图中，滇藏木兰、凹叶木兰、光叶木兰、武当木兰具5个共衍位点，形成一个单系类群，得到100%的计算机自展值支持4。在本研究中，凹叶木兰与武当木兰显示较近的亲缘关系，遗传距离仅为0.152，而二者与滇藏木兰的遗传距离达到0.421。形态上，滇藏木兰的叶纸质，深绿色，花被片12-16，倒卵状匙形或长圆状卵形，基部渐狭成爪，外轮3片平展，或外反折向下垂，最内轮直立，靠合，宽卵形或近圆形，为茶杯和茶碟形，而玉兰亚属其它种类的叶绿色或浅绿色，花被片9-12，平展或下垂，内轮花被片狭倒卵形或狭长椭圆形，均与滇藏木兰花形不同。由图2及表3可知，在分支1中，白玉兰和宝华玉兰的亲缘关系最近，遗传距离仅为0.092，二者形成一支后，与黄山木兰聚在一起，后者与前两者的距离系数分别为0.157和0.162，显示这3个种间具较近的亲缘关系；二乔玉兰原为白玉兰与辛夷的杂交后代，现广泛栽培，其与前者的距离系数为0.162，与后者为0.233，显示该种与白玉兰的亲缘关系更近一些。在形态上，二乔玉兰除紫红色花被片与辛夷相同外，其分枝习性（乔木）、花形、叶形（倒卵状椭圆形）及毛被状况均与白玉兰更为接近。在分支2中，湖北白玉兰、凹叶木兰分别与武当木兰的距离系数为0.173和0.152，显示二者均与武当木兰的亲缘关系很近，而二者之间的关系稍远，为0.227。这与形态学分类及分子序列分析结果一致。凹叶木兰和武当木兰都有红色的大型花朵，花被片10-12（14或17）倒卵状匙形或狭倒卵形。花丝紫红色，雌蕊群绿色，花柱紫色或玫瑰红色，二者的产地在四川中部有重叠。湖北白玉兰由Rehder（1913）先作为白玉兰的变种M.denudata var.elongata发表，后他（1927）又将其作为种M.elongata发表。1955年又作为武当木兰的变种重新发表，即M.sprengeri var.elongata13。RAPD的结果显示，其与武当木兰的亲缘关系较与白玉兰（二者距离系数为0.263）的更近，作为武当木兰的变种更合适。形态上，该种比武当木兰花小，花被片白色，短且狭窄，灌木。分支3只有紫玉兰1种，在经典分类系统中，该种和渐叶木兰为紫玉兰组的2个种，然而，RAPD结果显示二者的距离系数为0.628，而紫玉兰与玉兰组的白玉兰和二乔玉兰的，遗传距离分别为0.257和0.233，表明其与后两者的亲缘关系较前者近的多，在玉兰亚属所有种中，白玉兰和二乔玉兰也是与紫玉兰的亲缘关系最近的2个种。分支4的星花玉兰原产于日本，Maxim原将其作为日本辛夷的变型M.kobus f.stellata 发表，后（1872）作为种M. stellata发表，Blackburn（1955）将其作为日本辛夷的变种M.kobus var.stellata重新发表13 。RAPD结果显示其与日本辛夷的亲缘关系很远，距离系数达0.465，而与分布于中国的多数种类关系相对近一些，但这不排除是自然杂交和基因渐渗的结果。星花玉兰作为美丽的庭院观赏树种，栽培历史悠久，很早就引入我国，青岛、南京多有栽培，在长期的引种栽培的过程中，与中国原产的种类自然杂交后形成许多自然杂种个体，样株有可能是杂交后代。但总的来看，星花玉兰作为种比较合适。其与日本辛夷ndhF序列也有两个位点的差异4。分布于日本的另一个种柳叶木兰独自形成了分支。该种叶狭卵形至披针形，很少椭圆形，花梗和叶芽无毛，叶揉碎有茴香味，与玉兰亚属的其它种显著区别。该种在中国的栽培记载少见，与其它种遗传距离基本在0.400以上。该关系亦受到ndhF、matK序列分析结果的支持。分支由景宁木兰独立构成。该种为裘宝林1989年发表，与星花玉兰形态上很相近14，David（1996）将两个种合并13。RAPD结果不支持该处理，两者的距离系数为0.350。另外二者的产地一个在日本，一个在中国的浙江。形态上，景宁木兰当年生及前一年生的小枝绿色，叶先端渐尖或尾尖，花被片较星花玉兰宽短，长为宽的2.5倍左右，雄蕊外面具紫红色中脉，内面为淡黄色，雌蕊群及柱头黄色。星花玉兰当年生小枝灰褐色，叶较小，先端钝尖或微凹，花被片较细长，长为宽的3.5-4.1倍，雄蕊外为粉红色，内白色，雌蕊群绿色，花柱紫红色。分支中，天目木兰与望春玉兰具最近的亲缘关系，距离系数仅为0.168，日本辛夷与二者距离系数分别为0.194和0.233。 ndhF序列分析结果也表明，这3个种有一定的亲缘关系。但三者除叶长椭圆形至披针形，叶面略皱，先端渐尖至尾状渐尖，一年生小枝绿色外，没有其它的形态特征支持此种关系。伏牛山玉兰为赵天榜（1985）发表的新种15。David（1996）将该种归入望春玉兰13。RAPD结果显示其与望春玉兰的关系最近，遗传距离为0.205。结合外部形态考虑，该种花和叶较望春玉兰小，花被片内外均为白色，认为其作为望春玉兰的变种或变型更合适。4 结论本研究的结果证明，RAPD标记在玉兰亚属内具有很高的多态性。在基本分支上，与分子序列分析的结果相吻合，表明RAPD技术在低等级分类单元（种间）系统研究中具有一定的应用价值。RAPD及分子序列测定分析结果均不支持玉兰亚属以萼片状花被片、开花时间、花被片颜色作为分组的依据。该亚属为亚洲与美洲间隔分布的类群，说明地理隔离因素所形成染色体水平上的变化幅度要远远大于形态上的差异，建议玉兰亚属以地理分布特征作为分组依据，建立亚洲组与美洲组两个类群。致谢：感谢华南农业大学解新明博士后为本文提出宝贵的修改意见，特此致谢！参考文献1 Qiu Y L, Chase M W,Parks C R. A chlorplast DNA phylogenetic study of the easterm Asia-eastern North America Disjunct section Rytidospermun of Magnolia (Magnoliaceae)J. American Journal of Botany，1995,82:1582-1588.2 Azuma H,Thien L B,Kawano S. Molecular phylogeny of Magnolia based on chloroplast DNA sequence data(trnK intron,psbA-trnH and atpB-rbcL intergenic spacer regions) and floral scent chemistryA. In:Liu Y H ed.Proc. Internat. Symp.Fam.MagnoliaceaeC.Beijing:Science Press, 2000.219-227.3 Kunihiko UEDA et al.Molecular Phylogeny of the MagnoliaceaeA. In:Liu Y H ed.Proc. Internat. Symp.Fam