医学遗传学基因诊断与治疗

第十四章 基因诊断 Gene Diagnosis 20世纪40年代发现DNA是遗传物质以及50年代DNA的双螺旋结构被发现，进一步从本质上证实基因是决定人类一切生命现象的物质基础。 现在，人们已经从分子水平上认识到基因是一段能够编码一条到多条肽链氨基酸顺序的DNA。,在第18届国际遗传学大会上，全世界3000名科学家对人类的生老病死做了新诠释“不论是器质性疾病还是功能性疾病，都有必要在基因水平上去探究病因”。除此之外，人类正常的发育、衰老和死亡，当然也受基因的调控。”,传统的诊断,、问、望、听、触经验型判断的方法。 、化验/检验细胞、组织、大分子、小分子、酶、代谢物；微生物、免疫学、生物化学、病理学等。 、影像学X线、B超、CT、核磁共振、内窥镜等。 、特殊检查染色体检查、肌电/脑电/心电、骨密度、原子吸收光谱等。,随着技术水平的发展，这些诊断方法也在不断的提高和完善，在医学实践中发挥了巨大的作用。并还将有更先进的方法问世。 但这些方法大多存在一个无法克服的缺陷：不可预先诊断。,随着分子生物学和分子遗传学的发展，越来越多的证据表明，绝大多数疾病的发生和发展都与患者的遗传物质结构和功能改变有关，所以遗传物质的检查越来越显得必要。 基因诊断的定义 应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构和功能变化而作出的或辅助临床诊断的技术，称为基因诊断。,基因诊断具有灵敏度高、特异性强、费用低，并对许多疾病特别是遗传性疾病做出预先诊断的优点。它是一种极具发展潜力的诊断方法。 由于基因诊断发展的时间不长，人们对于基因，特别是致病基因的了解还有许多空白，因此许多疾病的诊断还主要依靠其他方法。此外，基因诊断的发展并非取代和抛弃其他方法，而是相互补充，共同发展。,基因诊断的对象,1. 病原生物的侵入，如肝炎、艾滋病、支原体、细菌、寄生虫。 2. 先天遗传性疾患， 如苯丙酮尿症、无丙种球蛋白血症。 3. 后天基因突变引起的疾病，如肿瘤。 4. 其它，如亲子鉴定、个体识别、法医物证。,基因诊断的内容 与疾病相关的遗传物质改变主要有两类， 1.遗传物质，即DNA或RNA的水平的变化。 如病毒感染时病毒基因及其转录产物在人体内的从无到有，某些肿瘤中癌基因表达水平的从低到高。,2.遗传物质的结构变化，即基因突变。 如点突变引起的基因失活、染色体转位引起的基因激活或灭活等等。 因此，从理论上说，所有涉及基因结构和功能变化的检测都属于基因诊断。,基因诊断的原理 核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。 基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。 这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。,用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。进行基因检测有两个必要条件： 一是必需的特异的DNA探针； 二是必需的基因组DNA。 当两者都变性呈单链状态时，就能进行分子杂交。,基因探针 基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。,DNA探针根据其来源有3种： 1、来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomic probe） 2、是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNa 探针（cDNa probe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列 3、可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针,一、探针的 来源：,二、探针的制备 一般是通过分子克隆（molecular cloning）获得的。 克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。,当制备基因组DNA探针进，应先制备基因组文库，即把基因组DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运载体（噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主细胞如大肠肝菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。,制备cDNA 探针,离纯化相应mRNA,人工合成寡核苷酸探针,已知蛋白质的氨基酸顺序量,三、探针的标记,为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号,通常采用放射性同位素32P标记探针的某种核苷酸磷酸基。 近年来已发展了一些用非同位素如生物素、地高辛配体等作为标记物的方法。但都不及同位素敏感。,最常用的探针标记法,缺口平移法(nick translation)，,随机引物法： 即向变性的探针溶液加入6个核苷酸的随机DNA小片段，作为引物，当后者与单链DNA互补结合后，按碱基互补原则不断在其3OH端添加同位素标记的单核苷酸，这样也可以获得比放射性很高的DNA探针。,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease），又简称限制酶或内切酶。它们是基因工程和基因诊断重要的一类工具酶。 限制酶能特异地识别和切割特异的核苷酸序列，将双链DNA切成较小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分离出来。,每种限制酶识别和切割的通常为4-6个核苷酸序列,称为限制性位点(restriction sites)或切点。 限制酶切割双链DNA的方式有两种，产生的末端也有两种： 第一种是交错切割，即两条链的切点不在同一水平而是相隔数个碱基，故断口产生两小段自身互补的单链，这种末端容易互补连接，称为粘性末端（cohesive terminus）；,限制性位点,第二种为平整切割 ，即两条链在同一水平切开，得到平齐末端（blunt terminus）。,5GAATTC3 3CTTAAG5,5GGCC3 3CGCG5,由于具有相同粘性末端的DNA片段在DNA连接酶的作用下很容易共价连接，因此被广泛地应用于重组DNA操作中。具有相同平齐末端的DNA片段也可以连接，但连接效率只有粘性末端连接效率的1。,常用基因诊断的技术,1. Hybridization 2.聚合酶链反应 PCR 3.限制性片段长度多态性 RFLP 4.扩增片段长度多态性 AFLP 5.寡核苷酸探针 ASO 6.单链构象多态性 SSCP,每个人的DNA是不完全相同的，一般每100500bp就有一个是不相同的，即多态性。在两套基因组DNA中平均有1000万处不同，它们多位于内含子序列中。碱基的变异就可能导致酶切点的消失或新的切点出现，当使用同一限制酶切割不同个体基因组DNA时，DNA片段长度出现差异，这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）。 RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。RFLP可用Southern印迹杂交法检出。,1. RFLP (restriction fragment length polymorphism),等位基因2由于出现新的切点，DNA片段缩至8kb。,DNA片段电泳后杂交图,RFLP的检出等位基因1因有额外切点而导致产生两个长短不同的DNA片段（3kb及5kb）且均能与探针杂交。,在人类基因组中还存在一类DNA重复序列，称为小卫星DNA。它们分布十分广泛，每个重复单位通常只有几几十个碱基对，但其重复次数在人群中是高度变异的，又叫数目变异的串联重复（variable number tandem repeats,VNTR）。当用限制酶切割VNTR区时，只要酶切点不在重复区内，就可能得到各种长度不同的片段，可用于致病基因的连锁分析。,串联重复的短片段的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（AFLP）连锁分析法。 PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析。,2. AFLP（ amplified fragment length polymorphism）,当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时需要合成两种或两种以上的探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来。,3. ASO（allele-specific oligonucleotide）,PCR可结合ASO，即PCRASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。,等位基因特异的寡核苷酸探针(ASO)检测点突变,4、聚合酶链反应 （polymerase chain reaction,PCR）,PCR原理,PCR原理,变性,PCR原理,复性,PCR原理,延伸,PCR原理,变性,PCR原理,复性,PCR原理,延伸,PCR原理,变性,PCR原理,复性,PCR原理,延伸,DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线性形式扩增 (2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。,预变性(92-95C,2-5m),变性(92-95C,30s),复性 (40-60C,30s),延伸 (72C,30-60s),总延伸 (72C,7m),(25-35),PCR的一般过程：,经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。,5、Southern 杂交法,细胞,基因诊断的临床检测应用,1. 基因诊断在感染性疾病检测中的应用 乙型肝炎病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（HPV）： 其DNA可以使用点杂交、PCR方法直接检出。 丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺陷病毒（HIV）： 其RNA可以使用RT-PCR方法直接检出。 结核杆菌和疟原虫的分型可以使用探针杂交和PCR方法检出。,丙型肝炎(HCV)基因诊断实例,丙型肝炎为RNA病毒，9500mer，编码3011-3033个氨基酸，具有高变异性。基因组组成：,NCR: 非编码区,5- NCR为保守的区域，将引物设计在该区域，进行RT-PCR, 可特异性的扩增HCV。,PCR引物： +: 5-GATTCTCGAGGCGACACTCCACCATAGAT -: 5-ATACTCGAGGTGCACGGTCTACGAGACCT,2. 基因诊断在遗传病检测中的应用 镰状细胞贫血症（ globin，6 ），其GAGGTG的突变，可用RFLP（Mst II，CCTNAGG）或PCR-SSCP检出。,甲型血友病（FVIII，XR） 可用PCR-RFLP检出。,142 bp 99 bp,3. 基因诊断在肿瘤检测中的应用 在许多肿瘤中存在的 癌基因 ras、myc等的突变 抗癌基因P53、Rb等的突变、丢失 可用PCR、PCR-ASO、PCR-SSCP等方法检出。,4. 基因诊断在个体识别中的应用 鉴定基因多态性的方法均可用于： 亲子鉴定、个体识别、法医物证,基因治疗 （gene therapy）,基因治疗的策略,1、生殖细胞基因治疗：生殖细胞基因治疗(germ cell gene therapy)是将正常基因转移到患者的生殖细胞（精细胞、卵细胞中早期胚胎）使其发育成正常个体，显然，这是理想的方法。 1、体细胞基因治疗：体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗目的。,基因治疗的方法,1基因转移方法 （1）特异正常基因的分离与克隆： （2）外源基因的转移： 基因转移（gene transfer）是将外源基因导入细胞内。,基因转移方法：,1）化学法：将正常基因DNA（及其拷贝）与带电荷物质和磷酸钙、DEAE葡萄糖或与若干脂类混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，直接倾入培养基中与细胞接触，由于钙离子有促进DNA透过细胞有作用，某些化合物可扰乱细胞膜，故可将DNA输入细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，在适当的条件下，整合基因得以表达，细胞亦可传代。 方法简单，但效率极低，一般1000100000个细胞中只有一个细胞可结合导入的外源基因。,2）物理法：包括电穿孔法和直接显微注射法,电穿孔法：电穿孔法（electroporotion）是将细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性的穿孔，周围基质中的DNA可渗进细胞，但有时也会使细胞受到严重损伤。 显微注射法：显微注射（microinjection）是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因，这种方法应是有效的。但一次只能注射一个细胞，工作耗力费时。此法用于生殖细胞时，有效率可达10。直接用于体细胞却很困难。,脂质体法：脂质体（liposome）法是应用人工脂质体包装外源基因，再与靶细胞融合，或直接注入病灶组织，使之表达。,3）同源重组法：同源重组（homologous recombination）是将外源基因定位导入受体细胞的染色体上，在该座位因有同源序列，通过单一或双交换，新基因片段替换有缺陷的片段，达到修正缺陷基因的目的。,4）病毒介导基因转移：前述的化学和物理方法都是通过传染方式基因转移。病毒介导基因转移（viral mediated gene transfer）是通过转换方式完成基因转移，即以病毒为载体（vector）,将外源目的基因通过基因重组技术，将其组装于病毒上，让这种重组病毒去感染受体宿主细胞，这种病毒称为病毒运载体（viral vector）。,两种病毒介导基因转移方法,反转录病毒载体：反转录病毒虽是RNA病毒，但有反转录酶，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。 DNA病毒介导载体（DNA viral mekiated vector）：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等。,1、靶细胞,靶细胞：是指接受转移基因的体细胞。 选择靶细胞的原则是： 必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体分离又便于输回体内； 具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期; 易于受外源遗传物质的转化； 在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。,基因治疗存在问题与伦理学,存在着若干重要问题 1导入基因的稳定高效表达外源基因转移入病人体内细胞表达，首先与转移方法有关。化学和物理方法所导入的基因