结构研究中常用的波谱技术课件

天然产物化学导论,徐任生 主编,第一章 概论 第二章 天然产物的提取分离 第三章 结构研究中常用的波谱技术 第四章 生物碱 第五章 单萜 第六章 倍半萜类 第七章 昆虫激素与信息素 第八章 二萜类化合物 第九章 皂萜,结构研究中常用的波谱技术,第三章,结构研究是天然产物化学的一项重要的研究内容.从天然物中分离到化合物单体后,需进行结构鉴定,如果结构不清楚, 则无法进行下一步的药效学，毒理学，人工合成或结构修饰工作，更谈不上进行高质量的新药研究开发，其学术及应用价值将会大大降低。结构鉴定的方法有波谱法,化学法,文献调研等。,第三章 结构研究中常用的波谱技术,与合成化合物相比, 对天然化合物进行结构研究难度较大。因为合成化合物原料已知, 反应条件一定时可能得到什么产物，事先可作出某种程度的预测。但天然化合物则不然，即使不是新化合物，未知因素仍然很多。另外，对于一些超微量生理活性物质来说，因为得量甚少，难以采用经典的化学方法(化学降解, 制备衍生物等)进行结构研究， 而不得不主要依靠谱学分析的方法解决问题。,第三章 结构研究中常用的波谱技术,氢(1H)及碳(13C)核磁共振 1H-NMR 13C-NMR 是有机化合物分子结构测定中最重要的工具。 两者相辅相成，提供有关分子中氢及碳原子的 类型、数目、相互连接方式、周围化学环境乃至空间排列等结构信息， 在确定有机化合物分子的平面及立体结构中发挥着巨大的作用。,第一节 核磁共振谱,随着超导磁体 (supper conductive magnet，简称SCM) 脉冲傅立叶变换核磁共振 (pulse Fourier transform -NMR，简称PFT-NMR) 一维、二维及乃至多维核磁共振技术的不断开发， 结构研究的速度及质量大大提高。 对于几个毫克的微量物质，单用核磁共振技术即可测定其分子结构。 熟练掌握核磁共振的基本原理及其图谱解析技术对化学及药学工作者具有特别重要的意义。,第一节 核磁共振谱,一、核磁共振的基本原理 核磁共振，指原子核的磁共振现象。这种现象只有当把原子核置于外加磁场中并满足一定的外在条件时才能产生。并不是元素周期表中所有元素的原子核都能产生这种现象。只有显示磁性的原子核才会产生核磁共振现象，成为核磁共振的研究对象。 部分同位素的原子核(如1H、13C等)能够产生磁共振现象，因为这些核显示磁性，而产生磁性的内在根本原因在于这些核具有本身固有的“自旋”运动特性。 例如12C、18O等属于无磁性的原子核，不产生任何核磁共振信号。,第一节 核磁共振谱,一、核磁共振的基本原理 对不同种类的核来说，因核磁矩各异(表22)，即使是置于同一强度的外加磁场中，发生共振时所需要的辐射频率也不相同。 1H核磁共振所需射频约为13C核的4倍。 1H核磁共振所需射频(v)为100MHz， 13C核磁共振只需要约25MHz,第一节 核磁共振谱,一、核磁共振的基本原理,核磁共振技术有两个主要学科分支： 核磁共振波谱 (Nuclear magnetic resonance spectroscopy，简称NMR)。它是基于化学位移理论发展起来的，主要用于测定物质的化学成分和分子结构。 磁共振成像(Magnetic resonance imaging，简称MRl)。核磁共振成像技术是一种无损测量技术，可以用于获取多种物质的内部结构图像。,第一节 核磁共振谱,早期的核磁共振仪用永久磁铁或电磁铁来产生磁场。由于电磁铁和永久磁铁自身的局限，100MHz以上的谱仪磁场一般是由超导磁体产生。 超导磁体就是把超导材料制成的线圈放到液氦杜瓦中，使其处于超导状态，再给它加上大的电流，这样在线圈中间就能产生一个很强的磁场。由超导磁体做成的核磁共振波谱仪可以产生200M，300M，400M，500M，600M，800M，900M等超高磁场，对于化合物结构的解析有着非常重要的作用。,第一节 核磁共振谱,核磁共振仪,从事核磁共振波谱仪生产方面的厂家： 美国Varian公司， 瑞土Bruker公司 日本电子公司。,第一节 核磁共振谱,二核磁共振测试对于样品的要求 (1)样品纯度 样品纯度越高越好， 样品中不允许含有顺磁性物质。 样品不纯、混合物也可以进行NMR测试，只是谱图解析起来比较麻烦。 (2)样品制备 现代NMR仪器采用2H锁场技术， 制备样品时使用氘代溶剂。 常见的氘代溶剂：CDCl3、DMSO-d6、CD3OD、 (CD3)2CO、D2O等。 附表1为常用氘代溶剂的1H、13C化学位移,第一节 核磁共振谱,第一节 核磁共振谱,附表1 常见氘代溶剂的化学位移,第一节 核磁共振谱,附表1 常见氘代溶剂的化学位移,二核磁共振测试对于样品的要求 氘代溶剂较昂贵， 氘代溶剂的计量在0.5-0.7m1。 样品在氘代溶剂中有较好的溶解度。 氢谱需样品5-10mg。 13C原子的天然丰度较低，为1H的1100，且磁旋比仅为1H的14，需样品20-60mg。 样品太少或溶解性不好，会浪费时间，影响谱图的质量。 样品的溶液应该有较低的黏度，黏度太大的应该减少用量。,第一节 核磁共振谱,二核磁共振测试对于样品的要求 (3)核磁样品管 直径为5mm的核磁样品管，要求样品管内部干净、干燥，无杂质、残留水及溶剂等，样品管表面光滑，无划痕；样品管管帽与样品管管口能严密吻合。 (4)其他注意事项 如样品有毒性、腐蚀性、易爆性等特殊性质，需低温、避光保存等特殊要求，在测试时需要特殊测试条件等其他要求的，如低温实验、重水交换实验等，需要提前告诉测试人员。,第一节 核磁共振谱,三化学位移数据表 氢谱的发展最早、灵敏度最高，是人们研究的最多、最为广泛的一类NMR谱图，所以氢谱所积累的数据也是最为丰富的，常以图表的形式反映，见附表2、附表3。 附表2 各种含氢官能团的值范围,第一节 核磁共振谱,有磁矩的原子核（如1H,13C）在磁场作用下，以射频进行照射，产生能级跃迁而获得的共振信号，称为核磁共振。在测定天然产物成分结构时，是一重要手段。包括氢谱（1H-NMR）,碳谱（13C-NMR）。 1. 氢核磁共振 (1H-NMR) 氢同位素中, 1H的丰度比最大, 信号灵敏度也高, 故1H-NMR测定比较容易, 应用也最广泛。1H-NMR测定中通过化学位移()、谱线的积分面积以及裂分情况(重峰数及偶合常数J)可以提供分子中1H的类型、数目及相邻原子或原子团的信息, 对有机化合物的结构测定具有十分重要的意义。,第一节 核磁共振谱,（1）化学位移(chemical shift, ) 1H核因周围化学环境不同, 其外围电子云密度以及绕核旋转时产生的磁的屏蔽效应也不同。不同类型的1H核共振信号将出现在不同的区域(表1-2） 不同类型氢核因所处化学环境不同，共振峰将分别出现在磁场的不同区域据此可以进行识别。 待测氢核共振峰位置与基准物氢核共振峰位置比较，求相对距离，为化学位移。 氢谱化学位移范围 1-10ppm sp3 12 sp2 68 一般来说 烯氢 炔氢 烷氢,1. 氢核磁共振 (1H-NMR),基准物质 常用四甲基硅烷(tetramethylsilane，TMS) 为内标准。TMS结构对称，在1H-NMR谱上只给出一个尖锐的单峰；共振峰位于高磁场（ 0.00），绝大多数有机物的氢共振峰出现在它的左侧。,1. 氢核磁共振 (1H-NMR),化学位移的影响因素： 随着相连基团电负性的增加，CH3基氢核外围电子云密度不断降低，故化学位移值不断增大。,(2)峰面积与氢核数目 在1H-NMR谱上，各共振峰覆盖的面积与引起该吸收的氢核数目成正比。 峰面积用自动积分仪测得的阶梯式积分曲线高度表示。 积分曲线的总高度和共振峰的总面积相当，氢核的总个数；而每一阶梯高度则取决于引起该吸收的氢核数目,1. 氢核磁共振 (1H-NMR),(2)峰面积与氢核数目,1. 氢核磁共振 (1H-NMR),(3)峰的裂分及偶合常数(J) 已知磁不等同的两个或两组1H核在一定距离内会因互相自旋偶合干扰而使信号发生分裂, 表现出不同裂分, 如s (single, 单峰)、d (doublet, 双峰)、t (triplet, 三重峰)、q (quartet, 四重峰)、m (multiplet, 多重峰)等。,1. 氢核磁共振 (1H-NMR),(3)峰的裂分及偶合常数(J),1. 氢核磁共振 (1H-NMR),(3)峰的裂分及偶合常数(J) 两个小峰间的距离叫做自旋-自旋偶合常数(spin- spin coupling constant)，简称偶合常数J，用以表示两个核之间相互干扰的强度，单位以赫兹(Hz)表示。在HF中，偶合常数为JHF。,质子裂分后的谱线数()=n+1, 其中n为干扰核的数目。裂分间的距离为偶合常数(Coupling constant, J, Hz), 用以表示互相干扰的强度, 其大小取决于间隔键的距离。间隔的键数越少, 则J的绝对值越大; 反之,则越小。通常, 超过三根单键以上的偶合可以忽略不计。但在系统中, 如烯丙基及芳环, 因电子流动性较大, 即使间隔超过了三根键, 仍可发生偶合, 但作用较弱,1. 氢核磁共振 (1H-NMR),例 一未知化合物分子式为C6H12O3，IR在1740cm-1、1240cm-1、1060cm-1处有吸收，1H-NMR谱如图所示，解析结构。,因IR光谱示有1个酯羰基吸收(1740，1240，1060) 1H-NMR中各个信号归属如下：,由于氢谱中各类氢出现的范围仅0-10ppm, 使环境相近的氢往往分不开，大部分氢堆集成山形峰，不易检出。近年来碳谱得到迅速发展，碳谱的主要特点是化学位移范围宽达200ppm以上，可直接提供有关分子骨架结构的信息。氢谱和碳谱互相补充，成为研究天然产物成分结构不可缺少的工具。 在鉴定结构时,与1H-NMR相比, 13C-NMR无疑起着更为重要的作用。但是由于NMR的测定灵敏度与磁旋比(r)的三次方成正比, 而13C的磁旋比因为仅为1H的1/4, 加之自然界中的碳元素中, 13C的丰度比又只有1%, 故13C-NMR测定的灵敏度只有1H的1/6000, 致使13C-NMR长期以来不能投入实际应用。,2. 碳核磁共振 (13C-NMR),由于脉冲傅立叶变换核磁共振装置(Pulse FT-NMR)的出现及计算机的引入, 才使这个问题得以真正解决。 (1) FT-NMR的简单原理: 在脉冲FT-NMR装置中, 采用强的脉冲照射使分子中所有的13C核同时发生共振,生成在磁豫期内表现为指数形式衰减的正弦波信号(自由诱导衰减,FID), 再经傅立叶变换(Fourier translation)即成为正常的NMR信号(图1-31)。随着脉冲扫描次数的增加及计算机的累加计算, 13C信号将不断得到增加, 噪音则越来越弱。 经过若干次的扫描及累加计算, 最后即可得到一张好的13C-NMR谱。,2. 碳核磁共振 (13C-NMR),(2) 13C的信号分裂: 由于13C与1H均为磁性核, 故在间隔一定键数范围内也可通过自旋偶合干扰使对方信号产生裂分。1H-NMR谱中, 因为13C的自然丰度比较小, 故这种偶合干扰小,可以忽略不计。但13C-NMR谱则不同, 13C-13C之间的同核偶合影响一般可以不予考虑。而1H的偶合影响(异核偶合)却表现得十分突出。因1H核自旋偶合干扰产生得裂分数目仍然遵守n+1规律。以直接相连得1H得偶合影响为例, 13C信号将分别表现为q (CH3)、 t (CH2)、 d (CH)及s (C)。,2. 碳核磁共振 (13C-NMR),(3)常见13C-NMR谱类型及其特征 噪音去偶谱: 方法是采用宽频的电磁辐射照射所以1H核使之饱和后测定13C-NMR谱。此时, 1H对13C的偶合影响全部消除, 所有的13C信号在图谱(图1-33)上均作为单峰出现, 对判断13C信号的化学位移十分方便。另外, 因照射1H后产生的NOE效应, 连有1H的13C信号强度将会增加, 季碳信号因不连有1H,将表现为较弱的吸收峰。,2. 碳核磁共振 (13C-NMR),(3)常见13C-NMR谱类型及其特征 选择氢核去偶谱(selective proton decoupling spectrum,SPD)及远程选择氢核去偶谱(long rang selective proton decoupling spectrum,LSPD): 方法是对某个(或某几个)氢核进行选择照射, 以消除其偶合影响。 此时峰形发生改变的信号只是与之有偶合关连的13C信号。,2. 碳核磁共振 (13C-NMR),(3)常见13C-NMR谱类型及其特征 DEPT: 系通过改变1H 核的脉冲宽度（）或设定不同的弛豫时间，使不同类型的13C 信号在图谱上呈单峰形式分别朝上或向下伸出。 = 135 时 季C信号消失 CH3, CH CH2 = 90 时 季C信号消失 CH3, CH2信号消失 CH = 45 时 季C信号消失 CH3, CH2 ,CH ,2. 碳核磁共振 (13C-NMR),(3)常见13C-NMR谱类型及其特征 (4) 13C信号的化学位移: 13C-NMR谱与1H-NMR谱不同, 化学位移的幅度较宽, 约为200各化学位移单位, 故信号之间很少重叠, 识别起来比较容易。与1H-NMR一样, 13C的信号化学位移也取决于周围的化学环境及磁环境, 并可据此判断13C的类型。显然,改变某个13C核周围的化学环境或磁环境, 如引入某个取代基, 则该13C信号即可能发生位移。位移的方向(高场或低场)及幅度已经积累了一定经验规律。常见的有苯的取代基位移、羟基的苷化位移、酰化位移等,在结构研究中均具有重要的作用,2. 碳核磁共振 (13C-NMR),核磁共振谱,核磁共振谱,核磁共振谱,试对照结构指出图369，图370上各个信号的归属,核磁共振谱,试对照结构指出图369，图370上各个信号的归属,核磁共振谱,试从下列四个结构中选出一个与图谱3-71相符合的结构，并说明其理由。,b高场区有两组甲基质子信号，且一组呈t峰，一组呈d峰,试按给出结构对对二甲胺基苯甲醛的13C-NMR各个信号做出归属,一、引言 二维核磁共振(2D-NMR)波谱技术对结构测定产生巨大影响。 以往结构测定以积累、渐进的方式进行，依赖前人积累的知识库。要确定一个具有全新骨架的结构不容易，通过理化性质、波谱数据、化学降解、化学转换、半合成、全合成或晶体结构，经过数月乃至数年的努力才能完成。先查阅文献，收集代谢产物的信息。测定理化性质或进行点滴反应，判断属于何种类型，通过波谱数据判断与已知化合物库中某个化合物的结构差异等方法确定结构。,第一节 核磁共振谱,一、引言 至20世纪80年代，2D-NMR技术的发展，有可能对组成分子的1H、13C和15N等核的性质以及它们之间的连接关系进行详尽的研究，对化合物结构进行解析。天然产物的结构研究进入了跃进式发展：具有新颖构造的天然化合物的结构测定往往只要数周乃至数日就能完成，具有全新骨架的天然化合物层出不穷,第一节 核磁共振谱,一、引言 近年来，几乎所有化学，药物化学，生物化学和其他相关专业的学生都学习如何用核磁共振(NMR)波谱去鉴定化合物的结构。 对于一些专业名词(如化学位移、自旋-自旋偶合、偶合常数、连续波和傅里叶变换NMR谱、自旋去偶、NOE效应以及弛豫和弛豫时间等)这里不再重复， 重点介绍采用一维和二维NMR波谱进行结构解析策略和战术思想的运用和以这些策略为基础的天然产物结构的系统解析方法,第一节 核磁共振谱,二、2D-NMR波谱技术 2D-NMR起源于傅里叶变换的概念，即在时间范畴测得的NMR信号通过傅里叶变换就能得到频率范畴的NMR谱。如果把这个概念扩展到有两个时间变量的实验，通过傅里叶变换就能得二维频率的NMR谱(2D-NMR)。2D-NMR与1D-NMR一样，都是探测核的磁化矢量在磁场中进动时的相互间的相干作用。这种相干作用有两种：一种是通过共价键的标量偶合；另一种是通过空间的偶极相互作用，又叫NOE效应。,第一节 核磁共振谱,二、2D-NMR波谱技术 同核间的偶合作用，得到的就叫做同核相关谱(homonuclear correlation spectroscopy，COSY)，最常用的就是1H，1H-COSY。 异核之间的偶合关系，得到的就叫异核相关谱(heteronuclear correlation spectroscopy)最常用的是13C，1H-COSY。通过这些偶合相关信号的测定就能确定分子的共价键连接图式(即平面结构)。 探测核与核之间通过空间的偶极相互作用(NOE效应)，就能建立核与核通过空间的连接关系以及原子在空间的配置关系,第一节 核磁共振谱,二、2D-NMR波谱技术 2D-NMR特别适宜解决新颖有机分子的结构， 先了解结构测定的过程，大体三个阶段： 1)第一阶段是收集关于化合物最原始的信息(化学的、谱学的和生物来源方面的信息)，包括相对分子质量、分子式，特别是特定原子、官能团、发色团的存在及分子不饱和度等。 2)第二阶段是提出未知物的可能结构或后补结构。化学家一般把第一阶段得到的分子中官能团、片断和部分结构通过运用种种约束条件连接起来。,第一节 核磁共振谱,3)第三阶段就是尝试用后补结构去解释或归属所有能得到的波谱数据，必要的话，进行新的实验，包括详尽的波谱研究或化学实验去解析或验证候补结构。 对于某些极为复杂的天然产物，结构不可能由这么简单的步骤就能产生，常常还要进行降解而得到分子片断或部分构造，每一个片断或部分构造又作为一个新的未知物进行结构解析，最后把各个片断的结构综合起来，得到该化合物的完整结构。,二、2D-NMR波谱技术,2D-NMR用于结构解析的优势在于： 能够提供组成分子的各种核之间的相关与连接信息。 几乎所有的2D-NMR实验都包含核与核之间的相关，不管是同核偶合、异核偶合、NOE， 能够通过它们把分子片段直接地连接起来， 通过分子片段的组装就能够直接得到后补结构。,二、2D-NMR波谱技术,(一)最基本的2D-NMR实验方法 1H, H-COSY(质子间孪生、邻位和远程偶合相关) COSY是correlation spectroscopy的简称。 H, H-COSY是一种最简单的二维NMR实验， 在谱中，两个频率轴都以质子的化学位移作图, 谱图是方形对称的。一维1H-NMR谱的投影出现于对角线上(称对角峰或对角信号)。对角线以外信号称交叉峰或相关信号，它们处于1H 1D-NMR信号的水平和垂直连线的交叉点上，表明对应的两个质子间相互自旋偶合。 H, H-COSY谱揭示质子与质子间的自旋偶合关系。,二、2D-NMR波谱技术,2D-NMR H,H-COSY,1 1H -1H COSY 即1H 1H 相关谱,2H, H-NOESY 是方形的。对角线上对角峰， 对角线外相关峰揭示质子与质子间空间的相互关系 NOESY谱在结构解析中两方面的功能: 利用NOESY谱提供的相关信息，把分子中的原子或片断构造连接起来，通过空间的连接 当用H，H-COSY谱进行结构解析遇到困难的时候(如相邻质子间二面角接近900，偶合常数接近于零)，NOESY谱常常能够提供有用的信息。 在平面结构的解析中，通过空间的连接是对通过键的连接的有力补充 。,(一)最基本的2D-NMR实验方法,2 NOESY谱（1H 核之间的NOE相关） 为了在二维图谱上观察NOE效应而开发出来的新技术。在其谱中，不仅空间相近的质子间NOE效应可以观测到，而且还能作为相关峰出现在图谱上。,2D-NMR H,H-NOESY,3C, H-COSY 13C化学位移出现在x轴，1H化学位移出现在y轴，交叉峰出现在相应的13C和1H信号的垂直和水平连线的交叉点上。由于两个轴的频率不同，所以C，H-COSY谱图中不出现对角峰。 C，H-COSY谱简单明了，但提供的信息非常可贵。 提供C、H之间通过键的直接连接(1JCH)，清楚地告诉你在一个C原子上连接几个H原子， 揭示出哪个H原子连接在哪个C原子上，把质子与质子间的偶合相关信息转变成为C与C原子的连接提供了基础,(一)最基本的2D-NMR实验方法,2D-NMR C，H-COSY HMQC,2D-NMR C，H-COSY HMQC,3 HMQC谱 （ 1H 13C 近程相关）,4C, H-COLOC(孪生和相邻的CH相关) (HMBC) C, H-COSY提供了C, H通过1JCH偶合的连接， 只适用于解析接H的C原子，不适于解析不接H的季碳原子。C,H-COSY实验的一个变种适用于解析季碳原子, C,H-COLOC。 这种二维C，H相关谱检测C，H通过二键(2JCH)或三键(3JCH)的连接关系 谱中的交叉峰揭示的不是C，H之间隔一键(1JCH)的连接，而是隔二键或三键(2JCH和3JCH)的连接关系 实质是提供了C原子与C原子之间的连接,(一)最基本的2D-NMR实验方法,2D-NMR C，H-COSY HMBC,4 HMBC谱 （1H 13C 远程相关谱）,在一维核磁共振谱(1D-NMR)中, 如果信号过于复杂或者堆积一起难于分辩时, 则识别信号之间的偶合关系将十分困难。若采用二维核磁共振技术则会收到良好的效果。 1 1H -1H COSY 1H 1H 相关谱 2 HMQC谱 （ 13C - 1H COSY ） 13C 1H 近程相关（示1JCH） 3 HMBC谱 （ 13C - 1H COSY ） 13C 1H 远程相关谱(示2JCH,3JCH以上的13C 1H 相关) 4 NOESY谱（1H 核之间的NOE相关）,二维核磁共振(2D-NMR),把1D-NMR扩展为2D-NMR提供了许多优越性： 所有2D-NMR实验都包含有相关(同核偶合、异核偶合、NOE或其他)，这些相关信息为结构解析的原子或部分构造的连接提供了手段，即通过键的连接和通过空间的连接。 利用2D-NMR谱提供的相关信息就能直接地、毫不含糊地把分子的原子或分子片段拼接起来，从而大大提高了解析未知结构的能力。此外，相关信息的解析过程就是连接的过程，也是信号归属的过程。,二维核磁共振(2D-NMR),2D-NMR大大提高了信号的分解能力，使在1D谱中相互重叠的信号通过展开为2D而得到进一步的分离。如果谱图分辨率足够高，还可以通过谱图编辑(如作截面图)，进一步得到参与偶合相关的核磁共振信号的精细结构。 为共振信号的归属提供了有力的手段，共振信号相关的解析过程也就是波谱数据的归属过程，通过这种解析也就同时完成了数据的归属，而共振信号的完全归属是进一步讨论分子的立体化学(包括溶液构象)、研究分子运动性和分子间相互作用的基础,二维核磁共振(2D-NMR),总之，2D-NMR与1D-NMR虽然都是探测分子中核与核在磁场中磁矢量进动的相干关系，但2D方法是以更一般、更有效、更富有信息的方法来完成这种探测的，因此能提供许多用1D-NMR方法难以得到的结构信息。,二维核磁共振(2D-NMR),三、新颖天然产物结构测定法-从头开始的结构解析 对于结构复杂的新颖天然产物结构测定，从一开始就通过一维H谱和C谱，对C、H核加以分辨，通过DEPT谱和C、H相关谱对C、H核的性质和连接关系进行分析，再结合质谱或高分辨质谱的数据决定分子式。然后，就大量采用2D-NMR波谱技术，对这些核之间的连接关系进行解析，得到分子骨架。 再进行质子偶合形态分析和空间关系分析，必要时进行各种谱学编辑和处理，解决分子的构型和构象问题，同时对分子的骨架结构进行验证。,二维核磁共振(2D-NMR),三、新颖天然产物结构测定法-从头开始的结构解析 今天天然产物的NMR波谱分析的特点： 更多地运用杂核(如13C、15N)的NMR信息，更多地采用2D-NMR方法和NMR波谱编辑技术获得核与核相关和连接的信息，把分子片断连接成分子骨架。从大量的候补结构中寻找正确的结构，今天变得比较容易和快速。NMR技术反映了近代天然产物结构测定精髓。,二维核磁共振(2D-NMR),例：抗生素alborixin的结构测定 RVAl8对革兰氏阳性和阴性细菌显示较强的抑制作用,例：抗生素alborixin的结构测定 RVAl8对革兰氏阳性和阴性细菌显示较强的抑制作用,例：抗生素alborixin的结构测定,例：抗生素alborixin的结构测定 RVAl8对革兰氏阳性和阴性细菌显示较强的抑制作用,二维核磁共振(2D-NMR),练习 化合物分子式为C9H8O，试根据图推测其结构,练习 化合物分子式为C9H8O，试根据图推测其结构,练习 化合物分子式为C9H8O，试根据图推测其结构,练习 化合物分子式为C9H8O，试根据图推测其结构,C9H8O 推测结构,C9H8O 推测结构,C9H8O 推测结构,一、 化合物的纯度测定,在结构研究前必须首先确定化合物的纯度。 纯度不合格, 会给结构测定工作带来更大难度, 甚至会导致结构测定工作的失败。 纯度检查的方法很多： 1）有无均匀一致的晶形 2）有无明确, 敏锐的熔点 3）色谱方法, TLC，PC等。在三种展开系统中均呈现单一斑点时方可确认其为单一化合物。正相板和反相板。 4）气相色谱（GC）加热条件下能够气化的物质。 5）HPLC 则不受这个限制。用量少、时间快、灵敏度高，需配昂贵的仪器设备。,对未知天然化合物来说， 结构研究的程序及采用的方法大体如下: 1) 纯化和干燥化合物的样品 2) 通过文献调研，理化常数和化学定性分析等初步判断结构类型 3) 由波谱法等确定分子式，分子量，不饱和度；进一步推出结构官能团推出结构片断或骨架推出平面结构确定其构型，构象。,二、结构研究的主要程序,结构鉴定工作很难说有一个固定的程序。但有一点是共同的, 即文献检索, 调研工作贯穿结构研究的全过程。在植物分类学上亲缘关系相近的植物, 如同属, 同种或相近属种的植物, 往往含有结构骨架类似或甚至相同的化合物, 故在进行提取分离之前, 一般应当先利用中, 外文主题索引按中药名称或拉丁学名查阅同种, 同属乃至相近种的化学研究文献, 以充分了解前人的工作。,二、结构研究的主要程序,了解前人从该种或相近属种植物的哪个部位分到过什么成分, 这些成分出现在哪个溶剂提取部位，用什么方法得到，具有什么性质，分子式，mp，D，颜色反应，色谱行为及各种谱学数据等。根据该化合物在提取，分离过程中的行为，物理化学性质，对比上述文献调研结果，分析推测所得化合物的类型及基本骨架，利用分子式索引或主题索引查阅CA，进一步判断所得化合物是已知物还是未知物.,二、结构研究的主要程序,(一)确定分子式, 计算不饱和度 分子式的测定主要有以下几种方法. 1. 元素定量分析配合分子量测定 在进行元素定量分析前应先进行元素定性分析, 如采用钠融法等。元素定量分析，如果化合物只含C、H、O时, 通常只作C 、H定量, O则由扣除法求得。,三、结构研究中采用的主要方法,C 79.35% H 10.21% O =(100-79.35-10.21)% = 10.44% 各元素百分含量除以该元素原子量，得三种元素在结构中所占比例，以其中最小一项除以各数，得三者原子比。取整数，得实验式：C10H16O1 分子式为（ C10H16O1 ）n, n=1,2,3。确切的分子式待分子量测定后才能确定。,(一)确定分子式, 计算不饱和度,分子量的测定目前最常用的方法为质谱法(MS)。如电子轰击质谱(EI-MS)法测定分子离子峰(M+, m/z)为456。 即 （ C10H16O1 ）n= 456，n=456/152=3 分子式为 C30H48O3,(一)确定分子式, 计算不饱和度,2. 同位素丰度比法 已知组成有机化合物的主要元素均由相对丰度比一定的同位素所组成, 且重元素一般比轻元素重12个质量单位。 由重元素组成的分子将比由轻元素组成的分子重12个质量单位。在MS图上, 除分子离子峰M+, 还有M+1+及M+2+两个同位素峰。对一定的化合物来说, 其M+, M+1+及M+2+峰的相对强度应为一定值。同位素丰度比法可以求算分子式即根据这一原理。,(一)确定分子式, 计算不饱和度,3. 高分辨质谱法(HR-MS) 可将物质的质量精确测定到小数点后第3位。以12C=12.00000为基准, 则1H并不正好是1个原子质量单位(amu), 而是1.007825, 14N=14.00307, 16O=15.99491。,(一)确定分子式, 计算不饱和度,分子式确定后，计算不饱和度（Index of unsaturation,u） u = -/2 + /2 + 1 为一价原子（H,D,X）的数目 为三价原子（N，P）的数目 为四价原子（C,S）的数目 C30H48O3 u = 30- 48/2 + 0/2 +1 = 7,(一)确定分子式, 计算不饱和度,质谱(mass spectroscopy，MS)是记录分析样品在质谱仪中经高温(300)气化，在离子源受一定能量冲击产生阳离子，而后在稳定磁场中按质量和电荷之比(mz)顺序进行分离并通过检测器表达的图谱。图中的每一个峰代表一个质量数。根据分子离子峰(通常在最高处)与碎片峰的质荷比推导化合物的结构。高分辨质谱则直接给出相对分子质量的精确数字和分子式。这是解析化合物结构的重要基础,第二节 质 谱,有机化合物中各元素与其同位素的精确质量如下：,常用的离子源是电子轰击源，利用低能量(70eV)的慢电子轰击样品的气体分子使成阳离子， 电子轰击质谱 (electron impact mass spectra，EI-MS)。 电喷雾电离(electrospray ionization，ESI-MS) 基质辅助激光解吸电离 (matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI-MS)日益普及，,第二节 质 谱,联有飞行时间(time of flight，TOF)的 MALDI-TOF-MS与ESI-TOF-MS仪还可一次分析几千个生物大分子，促进了 高效筛选(high-throughput screening)药物的进程。质谱仪发展的另一热点是与液相色谱相联， LC-MS、 LC-MS-MS、 LC-ESl。,第二节 质 谱,质谱可用于确定分子量及求算分子式和提供其他结构信息。此外, 由于在一定条件下化合物的开裂还遵循一定规律,故比较试样与标准品在同一装置, 同一条件下测得的EI-MS图, 可以鉴定是否为同一化合物；如为未知化合物, 还可由分子离子丢失的碎片离子大小或由碎片离子的m/z值以及裂解特征推定或者复核分子的部分结构。,质谱(Mass spectrometry, MS),化合物分子经电子流冲击或用其他手段打掉一个电子后，形成正电离子，在电场和磁场的作用下，按质量大小排列而成的图谱。 质谱是研究化学结构常用的重要手段之一。由于质谱法样品用量少，提供的信息多，能与色谱法连用（GC-MS）。故在有机化学，石油化工，药物化学及环境保护等方面均得到了广泛的应用。,（二）质谱(Mass spectrometry, MS),电子轰击法（EI-MS）： 测定EI-MS时, 需要先将试样加热气化, 使之进入离子化室, 而后才能电离。故容易发生热分解的化合物或难于气化的化合物, 如醇, 糖苷, 部分羧酸等, 往往测不到分子离子峰, 看到的只是其碎片峰。而一些大分子物质, 如糖的聚合物, 肽类等, 也因难于气化而无法测定。,（二）质谱(Mass spectrometry, MS),一些对热不稳定的试样,如糖苷, 醇类等, 进行乙酰化或三甲基硅烷化(TMS化), 制成对热稳定性好的挥发性衍生物后再进行测定。另外, 还开发了使试样不必加热气化而直接电离的新方法, 如 化学电离(chemical ionization, CI-MS), 场致电离(field ionization, FI-MS), 场解析电离(field desorption ionization, FD-MS) 快速原子轰击电离(fast atom bombardment, FAB-MS 电喷雾电离(electrospray ionization, ESI-MS),（二）质谱(Mass spectrometry, MS),按电离方式的不同，最常使用的质谱为： EI-MS 电子轰击质谱 FD-MS 场解析电离质谱 FAB-MS 快速原子轰击电离质谱 ESI-MS 电喷雾电离质谱,（二）质谱(Mass spectrometry, MS),1. FD-MS（场解析电离质谱） 特别适合对热不稳定, 极性大, 难挥发的化合物的测定。捡出灵敏度高 (可达g), 谱图也比较单纯。大量事实表明:糖苷、氨基酸、肽类、核酸、抗生素等化合物在FD-MS谱中均显示明显的: M+H+ (M+1)， M+Na+(M+23), 甚至M+K+(M+39)峰, 并且随着发射丝电流强度的降低, 碎片离子峰越来越少, 而M+H+峰则越发突出。,（二）质谱(Mass spectrometry, MS),2. FAB-MS 快速原子轰击电离质谱 比较FD-MS与FAB-MS的测定结果, 可见FD-MS在高质量区提供的信息比较详尽, 但苷元部分的结构碎片信息则相对较少。可是FAB-MS则不然, 除了给出分子量及糖的碎片信息外, 在低质量区还给出了苷元的结构碎片, 从而弥补了FD-MS的不足。,（二）质谱(Mass spectrometry, MS),红外光谱(IR)是有机分子吸收红外光后产生化学键振动而形成的吸收光谱。 测定范围一般是max为5004000cm-1， 5001500cm-1为C-C、C-O、C-N等单键区， 15001800cm-1为CC、CO、CN等双键区，2200cm-1附近为C三C、C三N叁键区， 3500cm-1附近为O-H、N-H氢键区,第三节 红外光谱,将样品与KBr混合压片，能处理少至510g的样品，压片过程中不可避免吸收水分，在3400cm-1和1640cm-1附近常出现吸收峰，如将KBr片在lmmHg压力下于4050加热数小时可避免此现象.,第三节 红外光谱,由于核磁共振谱与质谱的普及，红外光谱的应用范围相对缩小。它主要用于鉴别各种 羰基(15001800cm-1)、 炔烃与腈基(22002300cm-1)、 羟基与胺基(35003600cm-1)等基团。 核对化合物，当两个化合物的红外光谱所有吸收峰，特别是灵敏的指纹区(5001500cm-1)的吸收峰完全吻合，则可确定两个化合物的结构完全一致。,第三节 红外光谱,分子中价键伸缩及弯曲振动将在光的红外区域, 即4000-625cm-1处引起吸收。测得的吸收图谱叫红外光谱。 分两个区，4000-1500cm-1的区域为特征频率区(function group region), 许多特征官能团, 如羟基、氨基以及重键、芳环等吸收均出现在这个区域, 并可据此进行鉴别。1500-600 cm-1的区域为指纹区(finger print region),其中许多吸收因原子或原子团间的键角变化所引起, 形状比较复杂, 犹如人的指纹,可进行化合物的真伪鉴别。,（三）红外光谱(Infrared spectra, IR),33003000 弱吸收 烯氢、芳氢、C=N 强吸收O-H、N-H 30002700 饱和C-H 24002100 不饱和三键 19001650 C=O及其衍生物 16801500 C=C及芳香核骨架震动、C=N等 15001300 饱和C-H面内弯曲振动 1000650 不饱和C-H面外弯曲振动,（三）红外光谱(Infrared spectra, IR),紫外光谱(UV)记录有机分子在吸收紫外光(max)200400nm后产生电子振动而形