石河子大学国家大学生创新性计划项目中期检查表.DOC

石河子大学“国家大学生创新性实验计划”项目中期检查表项目名称高抗氧化活性沙枣多酚的筛选及稳定性研究项目编号091075910项目成员李晓燕 马晓丽 张建军 夏吉飞 吴春燕指导教师刘红 教授成果形式研究报告或论文立项时间2009年 11 月 31 日 2010年 12月 31 日项目进展情况：自项目批准以来，该项目组成员按照项目任务书的计划安排，进行了明确的分工，各项工作一直有序进行。一、第一阶段：2009.122010.1进一步丰富文献资料，进行系统分析，详细制定项目研究方案。二、第二阶段：2010.22010.61. 多酚标准曲线的绘制。2、不同生长期沙枣果叶中沙枣多酚含量的测定及消长规律研究。三、第三阶段：2010.62010.81、对沙枣多酚对羟自由基能力的研究。2、对D-301大孔树脂进行预处理以及静态吸附实验的研究。研究成果概述:一、多酚标准曲线的绘制1、测定波长的选择取没食子酸溶液和沙枣提取液的稀释液各1.0 ml， 分别与各显色试剂混合均匀并定容至25 ml，室温避光放置，以1.0 ml蒸馏水代替样品作空白，在440860nm波长范围内进行扫描，得到没食子酸和沙枣提取液经显色反应后的吸收光谱，选择测定的最佳波长为765nm。2、显色体系中各试剂的用量Folin-Ciocalteau试剂与10%Na2CO3比例准确移取1ml没食子酸对照品溶液，加入0.50 ml Folin-Ciocalteau试剂，加入不同体积10% Na2CO3 溶液，经显色反应后加水定容至25ml，放置反应一段时间后，于分光光度计上测定吸光值。表 1 10% Na2CO3体积（mL）1.002.003.004.005.00吸光度值0.1870.2330.2960.3230.334结果表明，Folin-Ciocalteau试剂与10%Na2CO3比例为1：10。 Folin-Ciocalteau试剂用量取1.00ml没食子酸对照品溶液，加入0. 503.50ml Folin-Ciocalteau试剂，加入相同体积的10%Na2CO3 溶液，经显色反应后加水定容至25ml，放置反应一段时间后，测定吸光值。表 2Folin-Ciocalteau用量0.501.001.502.002.503.003.50吸光度值0.2720.1860.1850.1860.1920.1770.124当Folin-Ciocalteau试剂用量为0.50ml时，吸光度值最大。3、显色时间将各比色试剂混合均匀后，室温避光放置，每隔30min时间测定其吸光值，确定比色体系显色反应完全所需要的时间。表 3显色时间（min）306090120150吸光度值0.4950.5030.5040.5050.505随着时间的增加，吸光度值增加，当反应时间为60min时，吸光度值增加趋势最大，随后保持平稳。因此选择60min作为反应时间。4、多酚标准曲线的绘制准确称取真空干燥（60干燥4h）至恒重的没食子酸标准品适量置于100mL棕色容量瓶中，用水溶解并定容至100mL，摇匀，作为对照品溶液。将配制好的没食子酸溶液配成浓度为4.43gmL-1、8.86gmL-1、17.72gmL-1、35.44gmL-1、70.88gmL-1、88.60gmL-1的溶液。分别取上述不同浓度溶液2mL加到25mL容量瓶中，然后依次加入2mL蒸馏水，0.5mL 2mol/L福林酚试剂，5mL 10%Na2CO3溶液，用水定容至25mL。室温下反应1h，在765nm下测定吸光度。由吸光度对浓度进行回归得方程：A=0.0091c-0.014（R=0.9996），曲线在4.43gmL-188.60gmL-1范围内对照品没食子酸的量与吸光度值呈良好的线性关系。表 4 不同浓度标准溶液的吸光度没食子酸浓度（gmL-1）4.438.8617.7235.4470.8888.60吸光度值0.0150.0630.1570.3160.6270.785 二、不同生长期沙枣叶中沙枣多酚含量的测定及消长规律研究在前期的研究基础上，确定超声辅助提取沙枣多酚的最佳提取方案:固液比为1:12， 溶剂为70%的乙醇溶液，超声法提取3次（温度为25），每次20min。表5 不同生长期沙枣叶中多酚含量数据表时间/月0.511.522.533.5含量（mg/ml）0.0450.2490.420.6290.7250.7110.705时间/月44.555.566.57含量（mg/ml）0.6790.6160.5870.5720.4210.2820.273由上图可知，沙枣叶中多酚的含量，随生长期的不同而不同，整体趋势为先增大后减小。叶子6月份达到最大值。三、沙枣多酚对羟自由基能力的研究在25ml容量瓶中依次加入1.0mL，7.5mmoL/mL邻二氮菲溶液，5.0mL PBS(PH=7.4),1.0mLFeSO4溶液，1.0mL，0.1%H2O2,蒸馏水定容至25mL作损伤管。取7.5mmoL/mL邻二氮菲溶液，5.0mL PBS, 1.0mLFeSO4溶液定容至25mL作未损伤管。取7.5mmoL/mL邻二氮菲溶液，5.0mL PBS，1.0mLFeSO4溶液，1mL提取液，1mL0.1%H2O2定容至25mL作加药管。根据下面公式计算提取液对羟自由基的清除率。 清除率=（A药-A损伤）/A未损伤-A损伤表 6不同生长期沙枣叶中多酚清除羟自由基能力数据表时间/月0.511.522.5清除率0.0440.3770.6540.8800.938时间/月33.544.55清除率0.9750.9560.9200.8870.785表7 不同生长期沙枣果中多酚清除羟自由基能力数据表时间/月7891011清除率0.5940.8840.9500.9260.771实验结果表明，随着生长期的延长，沙枣叶和果中多酚清除羟自由基的能力先增强后减弱。四、大孔树脂的分离纯化1、大孔吸附树脂的预处理（1）取大孔吸附树脂，用95%乙醇浸泡24h，然后湿法装柱。（2）用95%乙醇冲洗层析柱（流速2BV/h，BV为树脂体积数，下同），至流出液加2倍蒸馏水后不产生浑浊为止，再用大量蒸馏水洗至流出液澄清。（3）继续用23BV的5%盐酸溶液洗层析柱（流速46BV/h），并浸泡23h，再用蒸馏水以同样的流速洗至中性。（4）用23BV的5%氢氧化钠溶液洗层析柱（流速46BV/h），浸泡23h后，再用蒸馏水以同样的流速洗至中性，用95%乙醇浸泡备用。2、静态吸附实验准确称取经预处理的树脂2.00克，分别置于250mL具塞锥形瓶中，加入50mL一定浓度的沙枣多酚提取液，置于20摇床，120r/min振荡吸附24h，测定溶液中沙枣多酚的浓度，按下式计算大孔树脂的吸附量及吸附率： Q吸附量(c1c2)V/W Q吸附率c1c2/ c1式中：c1吸附前溶液浓度（mgmL-1）c2吸附后溶液浓度（mgmL-1）V溶液体积（ml）W树脂重量（g）将吸附后的树脂过滤，并用50mL蒸馏水冲洗树脂，将其置于250mL的具塞锥形瓶中，加入50mL 60%的乙醇溶液，置于20摇床，120r/min振荡解吸24h，测定解吸液中沙枣多酚的浓度，按下式计算大孔树脂的解吸量及解吸率：Q解吸量cV/WQ解吸率Q解吸量/ Q吸附量100%式中：c解吸液浓度（mgmL-1）V解吸液体积（ml）W树脂重量（g）下一阶段工作计划：1、其它品种不同生长期沙枣多酚抗氧化活性的研究2、对D-301大孔树脂及硅胶分离纯化沙枣多酚优化条件的研究。3、进行高抗氧化活性沙枣多酚稳定性的研究4、整理数据，对前期所得数据进行处理，并撰写研究论文和结题报告。经费使用情况：实验材料费：0.4万元 测试费：0.09万元 专用玻璃仪器添置费：0.08万元 资料费、复印费等：0.05万元 采样交通费：0.07