实验4细胞的活力测定(MTS法.ppt

细胞的活力测定 （MTS法）,实验四,细胞活力：在细胞群体中活细胞所占的百分比叫做细胞活力.,为什么要进行细胞活力的测定？,由组织中分离细胞检查细胞活力以了解分离过程对细胞是否有损伤作用。 复苏后的细胞也要检查细胞活力，了解冻存和复苏的效果。 药物筛选等。,实验目的,1、掌握MTS法测定细胞活力的原理和方法。,2、了解细胞活力测定的相关应用。,3、熟悉酶标仪的使用。,4、掌握血细胞计数板的计数方法和原理。,实验原理,染色排除法（最常用）,台盼蓝法：死细胞染成蓝色，活细胞不着色 苯胺黑法：死细胞染成黑色，活细胞不着色,荧光排除法：,MTT法：琥珀酸脱氢酶可将MTT还原为蓝紫色结晶颗粒，后者产量与活细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比，反应完成后测定560nm时的吸光度。 MTS法的原理与MTT法相同（测定490nm吸光度值），灵敏度高，操作简单。,生活力强的细胞能发出强烈的黄绿色荧光；死亡细胞无荧光。,细胞内酶与特定试剂的显色反应：,细胞活力鉴定的方法：,酶标仪,实验内容,1.测定抗癌药物对慢性粒细胞白血病(CML)细胞系的IC50.,2.细胞倍比稀释测定细胞活力.,IC50（ inhibitory concentration 50% ）：药物抑制细胞活力50%时的浓度。 单位：nM,uM,3.细胞计数.,实验目的 实验原理 实验材料 实验步骤 实验报告,线粒体超活染色与观察,实验材料,CML细胞系，抗癌药物，96孔细胞培养板,100ul-1ml/20-200ul移液器，1.5ml离心管，MTS, PMS,血细胞计数板，显微镜，酶标仪等。,实验步骤,1.测定抗癌药物对慢性粒细胞白血病细胞系的IC50.,两个班分组进行，统计人数，共分13个组。,取经梯度药物浓度（对照,0.078125，0.15625，0.3125，0.625，1.25，2.5，5，10 uM）处理72小时后的CML细胞系，每个浓度吸取100ul加入到96孔细胞培养板中（每个浓度设置3个复孔），同时设置3个空白对照（培养基），将MTS和PMS解冻后，按MTS:PMS体积比为20：1的比例混匀（先数一下有多少孔，再计算需要MTS和PMS的体积，配制时多配3孔），每孔加入20ul，将细胞培养板置于细胞培养箱中培养4个小时后，取出细胞培养板使用酶标仪测定490nM波长时的吸光度值，以实验对照（不加药）为100%活力，在Excel电子表格中作图（计算时各组吸光度值均先减去空白对照的吸光度值再进行计算），绘制药物作用曲线，X轴为不同药物浓度，Y轴为细胞的相对活力，并计算药物的IC50，评价药物的抗肿瘤活性。,2.细胞倍比稀释测定细胞活力.,取CML细胞系1ml（细胞浓度约为5*106个/ml）于1.5ml离心管中，编号为第1管；取7个1.5ml离心管编号为2-7管， 向第2-7管中分别加入500ul培养基；管1颠倒混匀数次后，吸取500ul细胞加入到管2，管2颠倒混匀后吸取500ul细胞加入到管3，依次类推直到第7管；各管吸取100ul加入到96孔细胞培养板中（设置3个复孔），同时设置3个空白对照孔（培养基）。将MTS和PMS解冻后，按20：1的比例混匀，每孔加入20ul，将细胞培养板置于细胞培养箱中培养4个小时后，取出细胞培养板使用酶标仪测定490nM波长时的吸光度值，绘制细胞浓度（X轴）和细胞活力（Y轴），分析细胞活力与活细胞数量是否呈正比？ 注意：MTS和PMS需避光，操作时需避光操作。,空白对照每孔 加100ul 1640 培养基,实验对照每孔 加100ul细胞,从右到左分别加入100ul经10uM，5uM的梯度药物处理的细胞,空白对照 加100ul 1640 培养基,从右到左分别加入100ul经2倍梯度稀释的细胞,为了减少误差，每个浓度均设置3个复孔,1.加细胞和培养基。 2.细胞加完后，每孔加入MTS和PMS的混合液20ul ，VMTS:VPMS=20：1，先计算需要多少孔，可以多配6孔,血细胞计数板,3、细胞计数原理和步骤,1 mm,厚度0.1 mm,1.浅蓝色区域（计数白细胞等细胞）： 数出4个大格的 细胞总数，除 以4得到每个大格平均数 ，即0.1mm3 含有的细胞数，再乘以10000即为每mL的细胞数。 公式： 细胞密度（个/mL ）=X4稀释倍数 104 （X为4个大格的细胞总数）,2. 正中央红色小格用于计数红细胞,计数前，如果细胞密度很大则先将细胞用台盼蓝溶液将细胞稀释一定倍数（如5倍），计算时需要在公式里乘以相应的稀释倍数，即得到细胞的实际密度。 根据个人习惯，计数时当细胞压到大格的边线时，遵循“数上不数下，数左不数右”的原则。 思考一下，位于计数池中央的红色区域，用于红细胞计数的方法（作业）。,细胞计数步骤,1.取一个血细胞计数板，盖上盖玻片； 2.取1个1.5ml离心管，加入80ul台盼蓝溶液，吸取20ul CML细胞系加入到台盼蓝中（稀释倍数为5倍），用移液器混匀后吸取10ul细胞，加入到血细胞计数室中。 3.先在低倍镜下观看计数时的构造，显微镜调到高倍镜下数出4个大格的数目后，代入到公式中计算出细胞的密度（个/ml）。,实验报告,实验四 细胞的活力测定 （MT