普列昂.第8次课(2012年秋季).ppt

二、疯牛病调控基因研究取得新进展 公共科学图书馆综合,1、中科院昆明动物所研究人员关注、分析及实验 1）全球18万多头黄牛感染疯牛病，无一例水牛患病报道？ 2）比较分析黄牛和水牛群体SPRN基因的启动子区、编码区和3区域，共发现117个种间固定差异； 一个12-bp的缺失/插入多态性，只存在黄牛Shadoo蛋白疏水结构域中； 水牛SPRN基因的启动子活性，显著高于黄牛的启动子活性； 具有疯牛病抗性的水牛大脑 Shadoo蛋白的表达量，高于对疯牛病敏感的黄牛。,2、推测，SPRN基因在朊病毒疾病中可能作为抑制因子，参与调控着朊病毒疾病的发展进程。,三、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells） 由日本科学家山中 ， 2006年首次用病毒载体将四个转录因子（Oct4、 Sox2、 Klf4 and c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重新编程为类似胚胎干细胞的一种细胞类型的技术；研究发现，iPS细胞同样具有自我更新和分化的全能性。,PNAS：（2009年8月）美国研究人员利用人体皮肤细胞培育诱导多功能干细胞，并成功分化出不同类型的视网膜细胞。意味着将来可以利用自身皮肤细胞进行修复受损的视网膜。,1、人体免疫系统包括两大类 非特异性和特异性免疫反应；皮肤/粘膜，吞噬细胞(炎症、发烧)、干扰素；免疫活性细胞。 特点：前者反应快，不具特异性/后者反应较慢，具特异性。 2、特异性免疫的工作原理：称免疫应答(由多种细胞参与)，涉及感应阶段反应阶段效应阶段。 3、特异性免疫应答涉及： 1）两条路径，B-细胞介导的体液免疫和T-细胞介导的细胞免疫。 2）两种特异性免疫的共同点和功能的不同点？,第八章 人体的防御系统，第九章普利昂,共同点：免疫应答的三个阶段都具有； 功能的不同点：B-细胞通过产生抗体消灭异己，T-细胞直接参加战斗。 4、人类病原物包括：低等动物，真菌，细菌和病毒。 5、病毒是微生物一个类群，形体极其微小/结构十分简单/侵染特定活细胞的遗传因子（没有细胞结构，不能独立生存） ，基本结构组成核衣壳结构。 6、病毒包括，RNA或DNA病毒；亚病毒(裸露RNA或蛋白质或缺陷病毒)。 7、寄主不同：微生物病毒，植物病毒，昆虫病毒和动物病毒。,三、普列昂的发现,1、以改进检测方法为突破点 目标：分离、纯化病原物、并加以鉴定，每一步都离不开检测方法。第一个进步：,实验材料，把搔痒病从羊转至小鼠 发病潜伏期 35年 45个月,第二个进步,第二个进步：检测方法的改进 (终点或潜伏期滴定检测法，病源物接种给小鼠或仓鼠）,共加快速度100倍！,得到实验结果？,2、实验结果难以公布,所有实验数据都表明：病原物不是预期的小型病毒，不含核酸，而是蛋白质粒子。,经过八年努力，1982年发表第一篇文章： 提出羊搔痒病病原物是一种蛋白质类的感染颗粒（Proteinoceous Infectious Particle, Prion）,普列昂概念的提出，引起轩然大波。 许多人问：没有核酸，这个病原物如何增殖？如何复制本身的遗传信息？,许多人怀疑：可能还是存在核酸，因为方法不精确，所以未能检测出来。,同样早有具讽刺意味例子最早提出肺炎双球菌实验的实验结果“核酸是遗传信息载体”时，亦有人怀疑？ 当时Avery 的报告未能引起多大重视。有人怀疑转化因子中起作用的是蛋白质，只是 Avery 未能检测出来。,普鲁西纳回忆说：8年一篇文章 在寻找核酸上，D.Riesuer 和我所花的功夫比其他任何人都多。普列昂中不含核酸！,3、更深入的研究，更意外的结果 随着研究的深入，得到更多打破传统观念的结果： 1）寻找Prnp基因 编码普列昂蛋白（PrP）的基因，不但在染病动物脑中存在，亦在正常动物脑中找到，而且表达得一样多。,分别把 Prnp 基因在正常和染病小鼠中的表达产物称为：PrPc和PrPsc PrP 蛋白不是病鼠才有；暗示，PrP sc 的出现，不是调节基因作用的结果。,2）普列昂蛋白（PrP c）在正常动物脑中的功能是什么？做了一系列实验没有找到答案。 借助基因工程技术 (Knock out，基因敲除) ？ 剔除 PrP 基因小鼠（PrP%）,看不出病症，似乎一切正常，亦能正常生育。 还是不能解开PrPc的作用之谜，遗憾！,3）PrP%小鼠作出贡献 把染病小鼠脑提取物，接种给PrP% 小鼠后不染病。同样鼠脑提取物，接种给普通小鼠 PrP+/+后被染病。 说明病原物仍有活性！,4） PrPc 与PrPsc结构比较：同一基因编码 氨基酸序列 RNA剪辑 翻译后修饰,均无差别(一级结构相同),5）最后，终于找到差别 PrPc 和 PrPsc 在高级结构上有巨大差别 PrPc PrPsc 螺旋 40 (4个) 21(2个) 折叠 3(理论上无) 54%(4个),傅立叶转换红外光谱和圆二色分析,6）PrP c 和 PrP sc 在高级结构上的差别, 必然影响细胞内的行为和 代谢。 PrP c PrP sc 胞内定位 细胞表面 胞质内 蛋白酶水解 水解完全 局部水解,PrP sc局部水解片断沉积在脑组织中,7）综合上面得到的结果，提出一个理论设想：,搔痒病的发生由于PrP sc 的入侵 “带坏”了脑细胞中原有的 PrP c 使 PrP c 重新折叠形成新的高级结构（变成了 PrP sc） 。 增多的 PrP sc 形成淀粉样斑块，造成脑细胞破坏，出现空斑。,(b)接着，初始和新形成的搔痒病粒子就攻击另外的两个正常的 PrP 分子,细胞质,核,(a)搔痒病 PrP的一个分子(红色)和正常的 PrP 分子(褐色)相接触并以某种方式展开而形成搔痒病构型时,(c)后者反过来又去攻击其他正常分子，以此方式连续进行下去直至搔痒病 PrP 积累到危害量。,什么叫 PrP sc “带坏” PrP c ？实际上是： 蛋白质大分子与蛋白质大分子之间的相互作用。 生物大分子之间的相互作用还包括蛋白质核酸之间的相互作用。正常、常见！ 8）蛋白质 / 蛋白质 大分子间相互作用 PrP sc 把 PrP c “带坏”。 这个基本的理论设想，除了以上述实验为基础，还进一步得到以后实验支持。 9）与人有关的几种普列昂病 家族克雅氏病（CJD）、库鲁病(Kuru) 羊搔痒症(scrapie)、牛海绵状脑病（BSE）,这些病 都是神经退行性疾病 都为显性遗传病、都十分少见 现在都找到 PrP 基因突变。,基因突变导致 氨基酸序列改变 容易出现 PrP sc 高级结构。 受PrPsc感染的患病体内PrPc容易被PrPsc催化转变构象PrPsc。 疯牛病的 PrP sc 可以使人致病！,四、争论还在继续,1、不少权威科学家仍持怀疑态度！ 怀疑的核心，病原物是否仅仅普列昂蛋白？是否还有未检出的核酸？ 明尼苏达大学微生物系主任 A.Haase: “诺贝尔奖委员会应等到确实证明仅仅是蛋白质本身在感染中起作用，没有其他因子参与，再授奖才合适。” 耶鲁医学院神经病理学主任L . Manuelidis: “诺奖的授予可能窒息不同观点的深入探讨。”, 美国媒体报道标题： “美国科学家因一项有争议的研究获诺贝尔医学奖”。,2、对Prion研究在深入，并向应用发展 1）研究深入：(多个Lab) 热休克蛋白Hsp60作为伴侣参与、无机离子Cu2+浓度过高，可能导致PrPsc的形成。,PrP-P分子中的糖链对维持正常的PrPc 构象所必需，缺失和突变利于PrPsc的形成。 2）普鲁西纳正在制药公司5千万美元资助下，把研究转向治疗普列昂病药物的开发。,一条科学成就的宣布，在全世界范围内，在短短几十天左右时间，从学术界到经济界、政界引起巨大而深刻的反响，是空前的 。 “克隆”一词也顿时变得妇孺皆知。,二、从一个细胞到一只羊,所有有性繁殖的生物，都是从一个受精卵发育到完整的生物体。 多细胞生物的一个受精卵经过细胞分裂和分化长成形形色色的个体。,各种植物动物皆如此！,1、细胞分化 在个体发育中，细胞的后代在形态结构和功能上发生差异的过程，称为细胞分化。（第3章已讲）,2、细胞的发育潜能 由一个细胞可能分化发育出多少种细胞？ 这就是细胞的发育潜能。 大致有三种不同的发育潜能： 全能性，多能性和单能性,全能性 具有能使后代细胞形成完整个体的潜能的细胞称全能性细胞。受精卵 多能性 具有分化出多种组织或细胞（但不能形成完整个体）的潜能的细胞称多能性细胞。,卵子受精过程,3、对于植物来说，分化成熟的体细胞， 仍保持全能性，仍有可能发育成完整植株。 第一例从一个植物体细胞 一棵植株的实验。（20世纪70年代初，1个胡萝卜细胞植株）,无性繁殖 杨柳插枝繁殖，红薯块根繁殖，土豆块茎繁殖 这些都还不是严格意义上的一个体细胞 一棵植株！,4、对于动物来说 随着分化的演进，细胞逐渐丧失其分化潜能。 全能性多能性单能性分化成熟的体细胞。,实际上，动物细胞丧失全能性的过程，开始得很早。（原肠胚）,5、分化成熟的动物细胞已失去全能性，不能发育成完整动物个体。原因？ 陆续进行探索动物细胞丧失全能性原因的实验。（两栖类、小鼠),受精卵在发育过程中，经过卵裂囊胚原肠胚器官原基生长和组织分化不同阶段，分化发育成完整的个体。上世纪60年代所做一个划时代实验：把美洲爪蟾的小肠上皮细胞核注入去核的卵细胞，结果发现一部分卵依然可以发育成蝌蚪，其中的一部分蝌蚪可以继续发育成为成熟的爪蟾。,以上实验得出的结论： 囊胚阶段的细胞乃至成熟的体细胞，其细胞核仍具有全能性可以并能够发育成完整的个体。因为，细胞核保持着全套基因组。,看来，关键在于细胞质。细胞质中有着决定细胞分化全能性的物质，称为分化决定子。 （目前为止，克隆所用的动物实验材料其中之一，都是去核卵细胞）,后来实验证明，细胞质中的分化决定子，是 RNA。它们对紫外线敏感，对 RNase 敏感。,信息体（informasome） 在卵子中，母体信息以核糖核酸蛋白（RNP）颗粒形式存在，其沉降系数比核糖体还大，称为信息体。,在卵子形成过程中，卵母细胞中含有 25 万种 mRNA，每种约 600个拷贝。这些 RNA 构成母体信息，决定受精卵的发育潜能。,在 1980年初，克隆实验已用小鼠取得成功。 囊胚细胞核去核成熟卵细胞！ 为什么1990年中后期，多莉羊实验成功仍会引起这么大的震动？,从使用囊胚细胞核到分化成熟的体细胞核是一个大进步。 从实验小鼠 到羊，也有所不同。 最重要的是时机：1980年初到1990中后期(新千年即将赋予生命科学更重要的使命）,三、多莉羊实验的设计和实施,1、实验过程,严密的实验设计 精心的操作过程 严格的结果检验,实 验 过 程,细胞核受体 Scottish Blackface ewe,细胞核供体,注射促性腺激素释放激素 经 28-33 h 排卵,培养于0.5%胎牛血清培养基中， 使从生长周期中出来停顿于G。,3436 h 取出核,苏格兰黑面母羊卵,9天胚 26天胎羊 6岁母羊孕期 最后三个月 胚细胞 胎羊细胞 乳腺细胞,分别进行,培养在羊输卵管上 6 天，分裂成长至桑椹期或囊胚期,细胞融合,移入假母（苏格兰黑面母羊）子宫, 13 胚/头假母,胚细胞,胚细胞,乳腺细胞,检测&结果？,2、实验成功的关键，血清饥饿 使细胞核和去核卵细胞，处于细胞周期中相匹配的阶段。 使结合在基因（DNA）上的调控蛋白脱落下来。 重新编程（repreogram, remodel ）,3、多莉羊实验的质疑 质疑：来自乳腺的细胞究竟是不是分化成熟的体细胞？(原来供细胞的母羊已死，无法考证！),回答：在 Nature 原文中已说明，怀孕期间胚胎细胞可能进入母体，有1/106 可能性；需要进一步实验。,四、多莉羊实验的理论意义和实践意义,1、理论意义 1）证实分化成熟的动物细胞核仍具全能性。 2）证实卵细胞质 对胚胎发育分化的决定性。,细胞质分化决定子RNA： 卵子形成过程中，卵母细胞中含25万种mRNA，每种约600个拷贝； 以核糖核酸蛋白颗粒(RNP)的形式存在； RNA构成母体信息，决定受精卵的发育潜能。,2、实践意义（多方面）,1） 蛋白质多肽类药物 (胰岛素、凝血因子、干扰素、生长因子) 1998年产 76 亿美元 2000 年产 185 亿美元,80年代初到九十年代初：10年基因工程用于生产蛋白质多肽类药物有很大发展。 细菌、酵母表达系统糖修饰、蛋白质折叠。 动物细胞培养太贵 、成本高。 转基因动物亦已成功。,产量 细胞培养法 5% 转基因羊羊奶中 25%50% 英国罗斯林研究所和 PPL 制药公司联合，50 只转基因羊，已传四代。 希望用克隆法生产 4000 只基因工程奶羊。,转基因动物提高了蛋白质 肽类药物的产量,乳腺生物反应器 荷兰 生产EPO的转基因牛 年产值 40亿美元 英国 生产-胰蛋白酶 一杯羊奶 6000美元 制剂的转基因羊 中国 中科院发育所 合作1998年6月得到两只体细 扬州大学 胞克隆羊，能分泌乳腺药物,存在的问题： 所得到的转基因动物在有性生殖过程中，容易丢失转入的基因和特性。,对克隆大动物有了强烈的客观需求,2） 器官移植： 角膜 、皮肤、肾、肝 、肺、心脏等,器官移植大量开展需要大量供体器官。,人体器官的代用品来自猪。,获得供器官移植的纯种猪需要： 去掉猪抗原性、移入人抗凝血因子 近交 20 代约需 20 年 克隆技术使纯种猪培育时间大为缩短。 3） 人类疾病的动物模型,克隆人体的步骤已描绘出！,4）珍稀濒危动物繁殖,克隆大熊猫实验已开始 据报道，将大象胚胎移入小鼠体内已获成功。,5）动物育种 克隆技术用于动物育种可以极大地加快育种的速度。,警惕危险：克隆产生的 后代，基因组成单一，失去对复杂环境变化的适应潜力；体细胞克隆产生的后代出现早衰.!,6）克隆羊带给我们的启示： 实验证实，多莉的端粒比同龄的绵羊短，说明细胞的年龄老； 事实上，99年多莉在34岁就出现了早衰的症状。 1996.7.5出生的多莉，已于2002.2.23静静的死去，年仅6.5岁！可谓“生的辉煌，死的震撼“！（绵羊的自然生理年龄1112岁） 克