外源化合物致突变作用.ppt

第七章 外源化学物致突变作用,Mutagenesis of Xenobiotics,2,一般毒性作用 特殊毒性作用 （致畸、致突变、致癌）“三致”作用,目的要求,掌握外源化合物的致突变作用 熟悉致突变作用的评价方法 了解致突变作用的遗传学基础,4,基本概念：突变、遗传毒理学、致突变作 用、致突变物 致突变的类型：基因突变、染色体结构异 常、染色体数目异常,【内容】,5,致突变作用机制 突变的后果：生殖细胞突变，体细胞突变 机体对致突变作用的影响 致突变试验,第一节 概述,DNA,RNA,蛋白质,基因就是指DNA中能编码蛋白质和功能 RNA的特定核苷酸序列,为什么子女与父母非常相象？,13.3 13.2 13.13 13.11 12 12 13.11 13.2 13.33 13.43,LDL-R, ,ApoE ApoCI ApoCII, ,等位基因,一对同源染色体统一基因座上的一对基因称为一对等位基因（allele）。 二倍体细胞每一个基因是成对存在的，每一对基因分别来自双亲的染色体的同一位置上，这个位置称为基因座（locus）。 等位基因之间有相互作用：如完全显性，不完全显性等。 非等位基因之间也存在相互作用。,复等位基因,在某一种生物的群体中，每一个基因座上可以有两个以上的等位基因，这就是复等位基因（multiple allele）。 例如人类的血型就是由IA,IB,i 3个复等位基因决定的，这几个基因各自编码特定的红细胞表面抗原。,外显子和内含子 基因的结构是断裂的（split gene）,原核生物的基因结构大多数是连续的，即基因编码蛋白质的序列是不中断的。而真核生物基因的编码序列是不连贯的，即在两个编码序列之间有一段不编码蛋白质的非编码序列。 编码序列称为外显子（exon），非编码序列称为内含子（intron）。 外显子是出现在mRNA分子中的基因序列；内含子则是不出现在mRNA分子中的基因序列。,不同基因的外显子和内含子的数量及其长度是不等的。,突变（mutation）：指遗传结构本身的变化及其引起的变异 即生物体的遗传物质发生了突然的、根本的、遗传的变化，因为这种变化起源于基因和染色体，因此是可遗传的变异,15,突变研究简史,16,现实生活中,自然界中的自发突变 转基因的动、植物 各种有害因素引起的突变（物理，生物，化学）,突变,诱发突变,自发突变：取决于时间、环境以及在基因 组中位置而随机变化,人类健康危害,新品种培育、选择、改良,发生过程短，频率高；可为人类利用，也可能对人有害,适应性突变：适者生存（如细菌耐药性）,遗传毒理学（genetic toxicology）,研究化学、物理和生物因素对遗传物质（DNA）及活细胞遗传过程的作用，以及人类接触致突变物可能引起的健康效应的学科。 主要研究致突变作用机理 寻找敏感检测系统发现和探究致突变物 提出评价致突变物健康危害的方法,突变是致突变作用的后果 致突变物（mutagen）：能引起突变的物质，又称诱变剂 遗传毒物（genotoxic agent）：因致突变物能引起遗传物质损伤，又称其为遗传毒物 遗传毒性：对基因组的损伤能力，包括对基因组的毒作用引起的致突变性及其他各种不同效应。 致突变性：引起遗传物质发生突变的能力。在一个实验群体中突变率可以定量检测。 （突变率）,致突变作用（mutagenesis）：指外来因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种能力可随同细胞分裂过程而传递,直接致突变物（direct-acting mutagen）:具有很高的化学活性，其原型就可引起生物体突变的物质 间接致突变物（indirect-acting mutagen）:本身不能引起突变，必须在体内经过代谢活化才具有致突变性的物质,第二节 外源化学物的致突变类型,遗传 基因突变 染色体结构改变 染色体数目改变,机理 以DNA为靶的损伤： 基因突变 染色体畸变 不以DNA为靶的损伤 染色体数目改变,突变的类型,1.本质相同，损伤的程度不同 2.基因突变在光学显微镜下不能观察 3.染色体畸变（结构、数目）可在光学显微镜下观察,mutated type gene：基因内存在突变位点的基因 wild type gene：没有发生突变的基因,1.基因突变,Genetic mutation：指基因在结构上发生了碱基对组成和排列序列的改变 两种：碱基置换、移码突变,24,A G T C,腺嘌呤 鸟嘌呤 胸腺嘧啶 胞嘧啶,碱基置换（base substitution）,错误配对的碱基在下一次DNA复制时按正常规律配对，于是原来的碱基对被错误碱基对所置换。,转换（transition）：嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的变化 颠换（transversion）：嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的变化 由某一碱基配对性能改变或脱落而引起的突变,突变的后果,同义突变（ synonymous mutation）:指没有改变基因产物氨基酸序列的改变 错义突变（ missense mutation）:指碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变 无义突变（nonsense mutation）:指某个碱基的改变使代表某个氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子，导致多肽链在成熟之前终止合成的改变,Tyrosine (Tyr) 酪氨酸 Serine (Ser)丝氨酸,无义密码子：UAA，UAG ，UGA,移码突变（frameshift mutation）,指发生一对或几对不等于3的倍数的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译为不正常的氨基酸 因为碱基序列所形成的一系列三联体密码子相互间无标点符号，于是从受损位点开始密码子的阅读框完全改变,移码突变的结果,从原始损伤的密码子开始一直到信息末端的氨基酸序列完全改变 使读码框架改变其中某一点形成无义密码，于是产生一个无功能的肽链片段 移码较易成为致死性突变 如果减少或增加碱基对刚好是3对，则产物的肽链中仅减少或增加1个氨基酸，其后果与碱基置换相似，与移码突变不一样，不包括在移码突变范畴,30,基因突变的案例白化病,一组由黑素合成相关的基因突变导致眼或眼、皮肤、毛发黑色素缺乏引起的遗传性疾病 酪氨酸酶缺乏或功能减退 发病率，2/1000 常染色体隐性遗传,31,基因突变的案例多毛症,23岁的墨西哥男子丹尼出生后就患有一种罕见的多毛症，全身都被浓厚的黑色毛发覆盖，看起来就像传说中的恐怖“狼人”。 据悉，丹尼一家五代人都患有这种“狼人综合征”，他和26岁的哥哥拉里从小便被当成“怪物”，被关进笼子中四处展出。 祖母携带这种变异基因，将它传给了后代。哥哥拉里、堂姐妹莉莉和卡拉、亲妹妹贾米、6岁侄女丹尼拉等,32,多毛症基因曾是人类身上的一种“失传基因”。当远古时代的人类还是长满毛发的灵长类动物时，身上就存在着这种基因，但当人类渐渐进化后，这种基因变得不再需要，就开始发生突变而“关闭”。然而丹尼的家族不知何故，他们体内被“关闭”的多毛症基因现在又被“打开来了”。 “狼人综合征”非常罕见，患病概率只有100亿分之一，且没有根治办法。,2.染色体畸变,染色体结构异常（structual chromosome aberration）：指由于染色体或染色单体断裂，造成染色体或染色单体缺失或引起各种重排，从而出现染色体结构异常,染色体畸变类型,在下一次细胞分裂时断片因无着丝点，故不能进入分裂的核中而滞留在细胞质中，称为“微核”,（1）裂隙和断裂：指染色体上狭窄的非染色带，过去以宽度超过染色单体宽度为断裂，反之为裂隙,（2）无着丝点断片和缺失,染色体畸变类型,后果： 稳定的畸变(如倒位、易位)：染色体重排，可在机体或细胞群传递 不稳定畸变（无着丝粒断片、环状染色体）：因丧失重要遗传物质或有丝分裂障碍致细胞死亡。,（3）环状染色体,（4）倒位,（5）插位和重复,（6）易位,3.染色体数目异常,动物正常体细胞染色体数目2n为标准 异常：整倍性畸变单倍体、三倍体、四倍体 非整倍性畸变比二倍体多或少一条或多 条染色体,发病率：1/800，1.25 以13亿人口计 1.25x13亿=162.5万。 体征：智力发育不全，发育迟缓，面容呆滞，眼 距宽。眼裂小，外眼角上斜，鼻根扁平，张口伸 舌，流涎水缺乏抽象的思维能力，只会发单音节。 常伴有四肢、五官、内脏、皮肤等方面的异常。 50%患者伴有先天性心脏病，是死亡的主要原因。白血病的发病率高于常人20倍。,Down 综合征-为21-三体syndrome,Down（唐氏）综合征患者,第三节 外源化学物致突变作用的机制及后果,机理 以DNA为靶的损伤： 基因突变 染色体畸变 不以DNA为靶的损伤 染色体数目改变-非整倍体、多倍体,突变的DNA变化,碱 基 错 配,平面大分子嵌入DNA链,碱基类似物取代,碱基的化学结构改变或破坏,1.,二聚体形成 DNA加合物形成 DNA蛋白交联物形成,DNA链受损,碱 基 损 伤,2.,突变细胞分裂过程改变,其它：,3.,如甲基黄酸乙脂（EMS）,氮芥(NM),甲基黄酸甲脂（MMS）,亚硝基胍（NG）等，它们的作用是使碱基烷基化，EMS使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，结果产生的O-6-E-G和 O-4-E-T分别和T、G配对，导致GC对转换成AT对；TA对转换成CG,烷化剂与DNA共价结合,1.碱基错配 烷化剂（alkylating agent）：指对DNA和蛋白质具有强烈烷化作用的物质 一般情况下甲基化乙基化高碳烷基化,引起移吗突变,2.平面大分子嵌入DNA链,嵌入剂（intercalating agent）：指能以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间的物质 如吖啶类染料分子多数是多环的平面结构，特别是三环结构，其长度为6.8*102nm，恰好是DNA单链相邻碱基距离的两倍,5-溴尿嘧啶和T很相似，仅在第5个碳元子上由Br取代了甲基， 5-BU有酮式、烯醇式两种异构体，可分别与A及G配对结合,3.碱基类似物取代,指与碱基结构类似的化学物 碱基类似物能在S期中与天然碱基竞争，并取代其位置,4.碱基的化学结构改变或破坏,化学物可对碱基产生氧化作用，从而破坏或改变碱基的结构，甚至引起链断裂 如甲醛、安吉甲酸乙酯、乙氧咖啡碱等在体内可形成有机过氧化物或自由基，可间接使嘌呤的化学结构破坏，出现DNA链断裂,DNA链受损,紫外线诱发胸苷二聚体,阻断DNA复制,DNA- 环丁烷嘧啶二聚体和4-6光产物 阻止DNA复制 引起细胞死亡,1.二聚体形成：,紫外线,加合物形成可活化癌基因，影响调节基因和抑癌基因表达,2.DNA 加合物形成,活性化学物质与细胞大分子之间通过共价键形成的稳定复合物如生物毒素、多环芳烃和芳香族类致癌物可使DNA形成大加合物，使DNA的立体构象发生明显变化，阻断受损部位的半保留复制和转录.DNA加合物(adduct)的形成被普遍认为是诱变作用的重要事件。,3.DNA蛋白交联物： （DNA-protein crosslinks，DPC）,稳定的共价结合物 对DNA构象与功能产生严重影响 许多外源化学物均可引起DPC的形成（烷化剂、醛类、重金属等）,4.DNA-DNA交联（DNA-DNA crosslinks，DDC）：DNA分子上一条链的碱基与互补链上的相应碱基形成共价连接,不以DNA 为靶的间接诱变,1.对DNA 高保真复制和修复有关的酶系统作用,一些氨基酸类似物可使与DNA合成有关的酶系统遭受破坏而诱发突变，脱氧核糖核苷三磷酸在DNA合成时的不平衡也可诱发突变 铍和锰除可直接与DNA相互作用外，还可与酶促放错修复系统相作用而产生突变,不以DNA 为靶的间接诱变,2.对纺垂体作用染色体分离异常,与微管蛋白二聚体结合 与微管上的巯基结合 破坏已组装的微管 妨碍中心粒移动 其他作用,52,突变的后果,突变的后果取决于化学毒物所作用的靶细胞 体细胞：其影响仅能在直接接触该物质的个体身体上表现出来，不可能遗传到下一代（肿瘤） 生殖细胞：其影响有可能遗传到下一代 （遗传性疾病）,其它： 致畸 衰老 心脑血管疾病 ,体细胞突变,肿 瘤,癌基因的活化与抑癌基因失活,生殖细胞突变,显性致死：使卵子不能受精或突变配子与正常配子结合后， 在着床前或着床后的早期胚胎死亡。 隐性致死：需要纯合子或半合子才能出现死亡效应。 非致死突变 产生遗传病。 对基因库的遗传负荷产生不良影响。 基因库是指某一物种的生育年龄群体于特定时期能将遗传信息传至下一代的基因的总和。 遗传负荷（genetic load)：指人群中每个个体所携带有害基因或致死基因的平均水平,致死性突变将导致死胎，它影响后代的数量而非质量。 非致死性突变主要影响后代的质量。,对我国人群的影响,我国大约有1600万新生儿,7080 %涉及遗传因素,50 %由染色体畸变引起,已存活的儿童，住院就诊的约有1/41/3患与遗传有关的疾病,精子从产生到成熟需要3个月,人群中，约 3 5 患某种单基因病 约 15 20 患某种多基因病 约 1 患染色体病,体细胞遗传病中的恶性肿瘤构成我国不同地区人群死亡原因的第一或第二位。,我国人群中智力低下的发生率约为2.2 ，其中1/3以上有多基因、单基因或染色体改变的基础。,遗传病对我国人群的影响,第四节 机体对致突变作用的影响,（1）损伤耐受机制：DNA遗传可绕过那些阻止DNA复制。 细菌重组修复 （2）修复机制：直接修复、切除修复,损伤修复,DNA执行高保真复制,修复DNA损伤,遗传信息代代相传，并且高度保真,指引起DNA损伤的反应是可逆性的,负责较大范围的损伤修复，将损伤或不正确的甲基去除和替换,重组修复,即双链DNA中的一条链发生损伤，在DNA进行复制时，由于该损伤部位不能成为模板，不能合成互补的DNA链，所以产生缺口，而从原来DNA的对应部位切出相应的部分将缺口填满，从而产生完整无损的子代DNA的这种修复现象。,60,DNA损伤的修复(直接修复),1.光复活（photoreactivation)：修复紫外线损伤产生的胸腺嘧啶二聚体，广泛存在原核和真核生物体内(光裂合酶) 2.“适应性”反应：主要是O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT)修复鸟嘌呤O6位的烷基化损伤,3.切除修复,在E.coli中的切除修复系统,损伤：突变的碱基错配或改变DNA结构,剪切：内切酶在损伤碱基位点两侧剪切,切除：外切酶除去切口间的DNA,合成：DNA pol 合成取代DNA,连接酶封闭缺口,DNA损伤修复的一般特点,遗传多态性,代谢酶多态性 修复酶多态性,1.DNA损伤不仅有外源因素所致，也可以是内源因素所致 2.不同类型DNA损伤通过不同DNA修复途径修复 3.不同DNA损伤修复速度不同 4.DNA损伤修复机制有些是基本的，有些可诱导 5.修复功能存在物种和个体差异 （人的修复能力约比小鼠强10倍）,CYP17基因多态性与乳腺癌关系的单因素Logistc回归分析,CYP 17基因编码的细胞色素P450 17 -羟化酶 ，参与雌激素代谢;A2/A2基因型的妇女与A1/A1基因型者相比，雌激素水平显著增高,可能影响许多雌激素相关疾病的发生与发展.,突 变,外源物质,终致突变物质DNA,解毒,68,突变模式： DNA损伤-修复-突变,任何DNA损伤，只要修复无误，突变就不会发生，如果修复错误或未经修复，损伤就固定下来，于是发生突变,DNA损伤修复的一般特点,遗传多态性,代谢酶多态性 修复酶多态性,1.DNA损伤不仅有外源因素所致，也可以是内源因素所致 2.不同类型DNA损伤通过不同DNA修复途径修复 3.不同DNA损伤修复速度不同 4.DNA损伤修复机制有些是基本的，有些可诱导 5.修复功能存在物种和个体差异,遗传因素既是化学毒物作用的靶部位，也是决定化学毒物毒作用性质和强度的重要因素,第五节 观察化学毒物致突变作用的基本方法,致突变试验的目的,检测外源化学物的致突变性，鉴定生殖细胞致突变物和体细胞致突变物 预测潜在致癌物 用于环境遗传毒物污染的监测及评价,观察项目的选择,1983年国际环境致突变物防护委员会（ICPEMC）提出的致突变试验遗传学终点,遗传学终点：指试验所观察到的基因突变，染色体畸变以及反映致突变过程中发生的其他事件 基因突变 染色体畸变 染色体组畸变 DNA原始损伤： DNA完整性的改变 DNA重排或交换,试验组合原则,一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。 一般认为配套实验应包括多种进化程度不同的物种，如原核细胞、低等和高等真核细胞。这样观察外源化学物在不同系统发育的多种生物体的致突变性，更具有说服力。 体内试验与体外试验配合。 体内试验接近实际情况，但由于毒性动力学或其他原因，有时会漏检致突变物。且在时间、经费、人力及物力均比体外试验花费大。而体外试验简便易行，通常检出率大大优于体内试验。它的明显不足在于生物转化及解毒等方面与体内不同。,基因突变试验： 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验 ） 、哺乳动物细胞基因突变试验 染色体畸变试验： 染色体分析 、微核试验 DNA损伤试验 ： 姐妹染色单体交换(SCE)试验 、程序外DNA合成试验,化学致突变物的检测,常用致突变实验,Ames试验 （1979年Ames BN建立）,检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。 试验菌株都在组氨酸操纵子中有一突变(his-)，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长，回复突变成野生型后能自行合成组氨酸，可在最低营养平皿上生长成可见菌落。 计数最低营养平皿上的回变菌落数来判定受试物是否有致突变性 标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变, TA100检测硷基置换突变,TA102对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感。,用 Ames法检测诱变剂,结果判断,只要一种试验株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物 只要四种试验菌株均得到阴性结果，才能认为受试物可能是非致突变物 不加S9混合液得到阳性结果直接致突变物 加S9混合液得到阳性结果间接致突变物,野生型细菌（原养型）,突变型细菌（组氨酸缺陷型）,正向突变,回复突变,鼠伤寒沙门氏菌,哺乳动物细胞,微核试验,经致突变物作用后，染色体无着丝点断片或因纺锤体受损伤而丢失的整个染色体在细胞分裂的后期仍留在子细胞的胞质内，成为一个或几个规则的次核，称为微核。 常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验。 PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认. 主要检测DNA断裂剂和非整倍体诱变剂,微核实验进展,体外微核：CHL/CHO/V79 外周血微核实验 双核细胞法 免疫荧光染色法、荧光原位杂交,单细胞凝胶电泳实验（SCGE）,原理：DNA带负电 。 在电泳槽中，DNA断片在电场的作用下，由细胞核中移出，并向阳极泳动，经荧光染色后见到细胞核和移出的DNA断片，形成有如彗星一样的彗星头和彗星尾，故称为彗星实验（comet test）,84,一条染色体的两条单体在同一位置发生同源片段的变换，称为姐妹染色单体交换。由于交换是对等的，所以染色体的形成没有改变，但用特殊的培养液和处理方法可以显示出来,姐妹染色单体交换 Sister-chromatid exchange, SCE,85,86,SCE的遗传学意义还不完全清楚，是否存在自发的SCE也还有争议，交换的机理尚未完全阐明，但它显然与DNA损伤和修复过程有关。作为一种简便和敏感的遗传学指标，它在诱变和肿瘤研究等领域中的应用十分广泛。例如，目前已知许多环境诱变剂、职业有害因素、抗肿瘤药物、病毒等都可以引起SCE率增加，Bloom综合征患者和某些肿瘤患者的SCE率也明显上升。,87,显性致死试验 Dominant lethal test,显性致死突变指哺乳动物生殖细胞染色体发生结构和数目变化，出现的受精卵在着床前死亡和胚胎早期死亡。 它是评价化学毒物对雄性动物的生殖细胞遗传毒性较好的方法之一。,88,染色体畸变分析 chromosome aberration assay,观察染色体形态结构和数目改变，又称细胞遗传学试验。 将观察细胞停留在细胞分裂中期相，用显微镜检查染色体畸变和染色体分离异常。,三、试验结果的评定,1.在评定阳性或阴性结果之前，应首先检查 实验的质量控制情况。 通过： 盲法观察； 阴性对照和阳性对照的设立； 资料的统计学分析； 试验结果的重现性。,2.阴性结果的判定条件 ： 最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃 量许可的最大剂量。比较 各剂量的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些外来化合物。,3.阳性结果的判定条件： 应当具有剂量反应关系 。 在一个或多个剂量组的观察值与阴性对照组有显著性差异。 如果低剂量组或低、中两剂量组与对照组之间的差异有显著性，而高剂量组差异无显著性，则阳性结果不可信或无意义。,4. 无论阳性还是阴性结果都要求有重现性， 即重复试验能得到相同结果。,四