《分子生物学实验》PPT课件.ppt

分子生物学实验,一、实验设计 二、实验操作 指导教师：林 凤,实验设计,基因工程菌的构建,载 体 目的基因,酶切,PCR扩增，酶切,载体片段,目的基因片段,+,连接,重组质粒,转化,重组子阳性鉴定,1、载体多克隆位点 2、缓冲溶液 3、温度 4、末端的性质,酶切位点设计,载体与目的基因的连接,1、粘末端 2、平末端 3、对照实验,连接产物的转化,1、核酸电泳检测 2、对照实验：空白和阳性,阳性重组子的鉴定,1、限制性酶切法 2、-互补法 3、插入失活法 4、杂交筛选法,construction of expression vector,NcoI CCATGG GGTACC XhoI CTCGAG GAGCTC,实验操作,碱裂解法小量制备质粒DNA-pUC18,接种子液至75 g/ml Amp的5 ml LB培养基,37 ，OD600 1.0,加氯霉素 100 g/ml,37，过夜,1.4 ml培养液,4, 6000 rpm, 2 min,沉淀加100 l 冰预冷溶液,剧烈振荡,弃去上清，尽可能除净培养液,室温，20 min,200 l 新配制溶液，快速颠倒混匀,冰浴5 min,150 l 冰预冷溶液，温和振荡,冰浴5 min,上清加入450 l饱和酚，混匀,4, 12,000 rpm，2 min,上清加入450 l氯仿-异戊醇，混匀,4, 12,000 rpm，2 min,上清加入300 l异丙醇，-20，30 min,4, 12,000 rpm离心5 min,500 l 70% 乙醇洗涤沉淀,4, 12,000 rpm，2 min,弃上清，空气干燥10 min,20 l TE溶解质粒DNA,4, 12,000 rpm，5 min,DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定,DNA的酶切与连接,酶切反应体系 1 2 ddH2O 19l 19l 10buffer 2.5l 2.5l 质粒DNA pBR322 3l pUC18 3l EcoRI 0.5l 0.5l 37 ，1 h 65 ，1015 min终止反应 取4l 样品，加入10Loading buffer 0.5l ，核酸电泳,连接反应体系 ddH2O 8.5l 10buffer 4.5l 酶切DNA pBR322 20l 酶切DNA pUC18 10l T4 DNA ligase 1l 16 ，15 h 取10l连接产物，核酸电泳（上步剩余酶切产物做对照） 其余连接产物用于转化,重组DNA的转化,（一）CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 0.3 ml菌种接种于30 ml LB培养基,37 ，190 rpm,OD600 0.375，冰浴10 min,4, 6000 rpm, 10 min,弃上清，加4 ml冰预冷 0.1M CaCl2,冰浴10 min， 4, 6000 rpm, 10 min,弃上清, 加入1 ml 0.1M CaCl2，分装200 l/管,（二）转化反应 分别加入连接产物20 l, 阳性对照质粒pBR322 1 l, 阴性对照pUC18 1 l, 空白对照,冰浴30 min,42 , 90 s,冰浴1-2 min,弃500 l 上清, 连接产物取100 l , 10 l各涂一平板, 空白，阳性对照和阴性对照200 l各涂一平板,加入800 l LB培养基,37 水浴5 min,3