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hTSHR胞膜外区片段真核表达载体的构建和表达【摘要】 目的: 构建人类促甲状腺激素受体（hTSHR）胞膜外区氨基端的两个片段hTSHRf（aa29100）、 hTSHRe（aa101278）的真核表达载体pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe, 并在CHO细胞中进行表达。方法: RTPCR法从人甲状腺正常组织的cDNA中扩增hTSHRf和hTSHRe,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5HisTOPO中, 经酶切、 PCR和测序鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行表达, RTPCR扩增转染细胞的cDNA、 Western blot分别鉴定hTSHR在CHO细胞中mRNA和蛋白水平的表达。结果: RTPCR分别扩增两个片段的阳性克隆株, 所得片段大小与预期一致, 经Western blot鉴定, 相对分子质量（Mr）分别为11900、 23600左右, 与预期的大小相符。结论: 真核表达载体pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe构建成功, RTPCR和Western blot检测证实重组质粒能在CHO细胞中高效表达, 为进一步研究pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe在体内的基因表达, 建立Graves病的动物模型奠定了基础。 【关键词】 TSH 受体 真核表达 Graves病人TSHR是一种跨膜性蛋白, 属于G蛋白偶联受体, 具有7次跨膜结构, 体内主要分布在甲状腺滤泡细胞膜上。hTSHR蛋白由764个氨基酸组成, 相对分子质量（Mr）为84500, 分为膜内区、 跨膜区以及膜外区3个部分1, 2, 编码hTSHR膜外区的基因长度是1300 bp, 研究表明TSHR是许多自身免疫性甲状腺疾病（autoimmune thyroid disease, AITD）中主要的自身抗原之一, TSHR膜外区（TSHR extracellular domain, TSHRECD）是其免疫原性区段, 抗TSHR的抗体大多结合于此段。本研究中克隆hTSHRECD氨基端的2个片段编码序列（188403 bp, 407904 bp）, 构建其真核表达载体, 并转染CHO细胞,进行稳定表达。1 材料和方法1.1 材料 CHO细胞由中国医学科学院血液病研究所药理室熊东升研究员惠赠,酵母提取物、 胰蛋白胨购自OXOID公司, Hams F12、 G418、 OptiMEM无血清培养基购自Gibco公司; FBS和bTSH购自Sigma公司。真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5HisTOPO和感受态E.coli TOP10 购自Invitrogen公司。DNA快速纯化回收试剂盒、 限制性内切酶Hind 以及Pyrobest DNA聚合酶购自TaKaRa公司; MMLV逆转录酶试剂盒、 化学发光试剂盒购自Promega公司; 质粒回收纯化试剂盒购自博大泰克公司; TRIzol试剂、 脂质体LipofectamineTM2000 Reagent及小鼠AntiHis单克隆抗体（mAb）购自Invitrogen公司; 引物设计合成由上海英俊公司完成。1.2 方法1.2.1 PCR引物设计与合成 根据GenBank公布的hTSHR cDNA序列（GenBank: 000369）序列分别设计片段188403 bp的引物F4: 5cac catg gag tgc cat cag gag ga g3, R4: 5act caa att gta gaa gga gtg tg3; 片段407 bp940 bp的引物F5: 5cac catg gtg act cac ata gaa at3, R5: 5tgg gta aga aag gtc agc c3。上游引物的5端序列起始密码子ATG前加人Kozak序列（划线部分）以提高转录起始的效率3。1.2.2 组织材料获取与总RNA的提取 人正常甲状腺组织30 mg, 加入1 mL TRIzol, 匀浆后加入200 L氯仿, 摇匀, 室温孵育23 min, 4, 11000 g离心15 min, 取上清水相至新离心管中; 加400 L异丙醇, 室温孵育10 min, 4, 11000 g离心10 min; 弃上清, 用1 mL750 mL/L乙醇洗涤1次, 4, 11000 g离心5 min; 弃上清,空气中干燥10 min, 加RNasefree水溶解, 测RNA浓度, -70保存。1.2.3 RTPCR 将人甲状腺正常组织RNA, 逆转录为cDNA, 以hTSHR cDNA为模板, 用Pyrobest DNA聚合酶PCR扩增TSHR片段, 上下游引物分别1 L（10 mmol/L）, dNTP1 L（2.5 mmol/L）, 10buffer2.5 L, Pyrobest DNA聚合酶0.30 L（1 U）, 模板2 L（约150 ng）, ddH2O17.2 L。反应参数: 95预变性2.5 min, 95变性45 s, hTSHRf62.7、 hTSHRe 54.1退火45 s, 72延伸45 s, 34个循环; 72再延伸5 min。10 g/LTAE琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。1.2.4 载体构建与鉴定 将回收的hTSHRf、 hTSHRe分别与载体1.51混合进行连接, 然后将重组体转化E.coli TOP10, 冰上放置530 min, 42热休克30 s后, 立即置于冰上, 加250 L 的S.O.C培基37摇床, 1 h; 铺板于Amp+的琼脂糖培养基上, 37温箱孵育16 h; 挑取单个菌落于LB液体培养基中, 扩大培养, 小量提取质粒DNA, 以质粒DNA为模板, 分别以F4R4和 F5R5为引物, Pyrobest DNA聚合酶扩增hTSHR, 反应条件同上; 经Hind 酶切后15 g/L琼脂糖凝胶电泳; 测序鉴定由上海英俊生物公司完成。1.2.5 CHO细胞转染与阳性克隆筛选 (1)转染用重组质粒的制备及纯化: 按照提取质粒试剂盒说明大量提取重组质粒, 并去除内毒素, A260/A280在1.82.0之间, -20保存, 用于转染。(2)脂质体转染: CHO细胞用Hams F12完全培养液（含100 mL/L FBS, 10 mL/L HT, 5 mL/L双抗）常规培养, 传代。转染前先对CHO细胞进行毒性筛选, 以确定其最小致死量, 将细胞铺板于96孔板中, 细胞密度为2104/孔, G418毒性筛选后确定最小致死量为500 mg/L。转染前1 d, 以2104/孔CHO细胞接种于96孔板, 每孔加100 L不含抗生素的Hams F12培养基, 使其融合密度为90%, 用25 L OPTIMEMI培养基分别稀释320 ng DNA和0.8 L脂质体2000, 后者稀释后室温孵育5 min, 混合稀释的DNA和脂质体, 室温保温20 min; 然后直接将复合物加入到每孔中, 37、 50 mL/LCO2孵育45 h后更换生长培养基; 次日, 将细胞传代至新鲜培养基中, 48 h后加入500 mg/L G418筛选阳性克隆株, 进行23周的稳定表达。1.2.6 目的基因在mRNA水平表达 分别提取转染后和未经转染的CHO细胞的总RNA, 逆转录为cDNA, 以cDNA为模板, F4R4和 F5R5为引物, PCR分别进行扩增, 反应参数同上。1.2.7 目的基因蛋白水平的表达 用200 L细胞裂解液裂解稳定表达的CHO细胞制备蛋白样品4, 120 g/L的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后, 将凝胶在转移缓冲液中浸泡15 min, PVDF膜剪成凝胶大小在转移缓冲液中浸泡1015 min, 恒流0.8 mA/cm2, 转膜12 h; 50 g/L脱脂奶粉的PBST 4 mL, 4封闭过夜, 次日, PBST洗膜, 5 min/次; 由于构建的重组表达蛋白的羧基端有多聚组氨酸6His的蛋白标签, 一抗用小鼠AntiHis mAb（18000） 4 mL, 37孵育2 h; 洗膜（同上）; 加HRP标记的羊抗小鼠 IgG（18000） 2 mL, 37孵育1 h; 洗膜（同上）。按照化学发光法说明书, 用发光检测液浸泡PVDF膜后, 在暗室中曝光30 s, 显影12 min, 定影5 min, 室温干燥。2 结果2.1 目的基因的获取 提取人正常甲状腺组织RNA, 经RTPCR后, 扩增产物经回收后10 g/L琼脂糖凝胶电泳, 分别可见约220 bp、 540 bp大小片段, 与预期相符。图1 目的基因RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳分析（略）Fig 1 Analysis of RTPCR product of hTSHR gene by agarose gel eletropheresisM: DNA marker DL 2000; 1: hTSHRf; 2: hTSHRe.2.2 重组质粒的转化与鉴定 pcDNA3.1D/V5HisTOPO为定向克隆载体, 2个片段均正向插入载体, hTSHR全长Hind 的酶切位点有3个: 272 bp、 784 bp和1236 bp, 载体的Hind 的酶切位点在T7启动子附近, Hind 在T7和272 bp对pcDNA3.1hTSHRf进行酶切, T7启动子与TOPO异构酶的识别位点之间以及188 bp与272 bp之间片段长度约为130 bp; Hind 在T7和784 bp对pcDNA3.1hTSHRe酶切, T7启动子与TOPO异构酶的识别位点之间以及407 bp与784 bp之间片段长度约为430 bp, 证实重组质粒的大小及插入方向是正确的（图2）; 测序结果与GenBank中hTSHR的相应片段序列相同。以质粒为模板PCR扩增产物大小分别约为220 bp、 540 bp, 与预期大小相符。图2 重组质粒pcDNA3.1hTSHRf 和pcDNA3.1hTSHRe 经Hind 酶切鉴定（略）Fig 2 Restriction endonuclease Hind analysis of the recombinant plamids pcDNA3.1hTSHRf and pcDNA3.1hTSHReM: DNA marker DL 2000; 1: pcDNA3.1hTSHRf; 2: pcDNA3.1hTSHRe.2.3 转染细胞中hTSHR mRNA表达鉴定RTPCR鉴定阳性克隆细胞, 扩增产物分别约为220 bp、 540 bp, 证明hTSHRf和hTSHRe已经成功整合在CHO细胞基因组中, 并能够转录, 而未经质粒转染的细胞未扩增出任何条带（图3）。图3 RT PCR检测目的基因的表达（略）Fig 3 RTPCR amplifying cDNA of CHO cells transfected by recombinant plamids pcDNA3.1hTSHRf and pcDNA3.1hTSHReM: DNA marker DL 2000; 1: RTPCR amplifying cDNA of CHO cells nontransfected; 2: pcDNA3.1hTSHRf; 3: pcDNA3.1hTSHRe.2.4 Western blot鉴定TSHR蛋白水平的表达 裂解阳性细胞株, 经SDSPAGE电泳后转印到PVDF膜, 与小鼠AntiHis mAb结合, HRP标记的羊抗小鼠 IgG作为二抗, ECL法显色, 根据标准分子量计算后, 特异条带的Mr约为11900、 23600, 与预期相符（图4）。图4 Western blot检测目的基因的表达（略）Fig 4 Western blot of hTSHRf and hTSHRe3 讨论 GD是一种常见的AITD, 其自身抗体TSAb可模拟TSH功能, 兴奋TSHR, 通过多种途径调节甲状腺细胞的生长、 分化, 激素的合成和分泌, 最终导致GD的发生。建立合适的GD动物模型是人们一直以来研究的热点, 目前, 报道的建立GD动物模型的方法包括TSHR真核表达质粒免疫、 表达TSHR的腺病毒免疫5、 表达TSHR的成纤维细胞或M12细胞免疫 6、 外源性注入TSHR活化T细胞以及TSAb转基因动物模型等, 最近有报道在体内电穿孔法注射DNATSHR复合物建立GD模型7, TSHR核酸免疫被认为是目前建立GD等AITD动物模型的最有希望的一种方法。Kim等8证明18.5%的GD患者体内有TSAb和TBAb两种抗体, 但主要是TSAb占优势, 95%以上未经治疗的GD患者血循环中均可检测出TSAb。研究表明, TSHRECD是TSH以及TSHR自身抗体的主要作用部位, 并拥有多个TSH的结合位点、 自身抗体的结合表位以及特异的免疫原肽9, 因此, 研究TSHRECD功能对于了解GD发病的分子机制方面尤为重要。研究发现TSAb大多数表位是位于TSHR ECD的氨基端（aa3437、 4045及525610）, Schwarz 等11研究证实, 建立GD模型不论是用表达TSHR的腺病毒免疫还是用TSHR的DNA免疫, TSHR的显性表位都位于其氨基端的富含半胱氨酸的残基aa2141。 报道的真核表达载体大多是用hTSHR全长构建的, 在前期的研究中, 我们针对性地用hTSHRECD氨基端的753 bp成功构建了真核表达质粒12, 为了进一步研究片段的功能, 我们又将其分成2个片段（aa29100, aa101278）, 分别构建了重组质粒pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe, 因该载体具有定向克隆功能, 保证了片段与载体正确定向的连接, 简化了克隆的过程和筛选的步骤, 并能使重组蛋白在CHO细胞中高效表达。结果显示, RTPCR扩增阳性克隆细胞株, 证实了hTSHR在mRNA水平的表达; Western blot证明hTSHR在蛋白水平有表达, 为进一步研究pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe在体内的基因表达, 建立GD动物模型奠定了实验基础。【参考文献】 1 Rocchi R. 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