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JC病毒蛋白VP3原核表达载体的构建及诱导表达 作者：李小权，毛羽，郑铁龙，成军，张树林，王琦，李兴旺【摘要】 目的 构建JC病毒蛋白VP3原核表达载体，并观察其表达情况。方法 通过聚合酶链式反应(PCR)获得VP3基因，将其连接到pGEMT载体，测序正确后插入至原核表达载体pET32a(+)中，转化BL21大肠杆菌，IPTG诱导，并通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)、Western blot免疫印迹分析鉴定融合蛋白的表达情况。结果 扩增获得VP3基因片段，成功构建了大肠杆菌原核表达JC病毒VP3载体。经IPTG诱导，得到了分子质量为59ku的目的蛋白，Western blot证实其具有良好的抗原性。结论 本研究成功表达了VP3蛋白，对于研究VP3蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了的基础。 【关键词】 JC病毒；VP3蛋白；原核表达 ABSTRACT: Objective To construct proeukaryotic expressive vector of VP3 gene of JC virus, and observe the expression of recombinant protein. Methods The DNA fragment of vp3 was amplified by polymerase chain reaction (PCR), and cloned into pGEMT vector. After sequencing, the correct DNA fragment was inserted into inducible proeukaryotic expressive vector pET32a(+) and transformed into E.coli BL21. The protein was induced with IPTG and analyzed with sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis and Western blot hybridization. Results The DNA fragment of vp3 was amplified by PCR. The expressive vector was constructed successfully. After induction with IPTG, recombinant target protein with Mr 59ku was expressed. Western blot analysis showed that the protein had good antigenicity. Conclusion The recombinant vp3 gene was expressed successfully. These results lay the foundation for studying the immunogenicity and bionomics of VP3 protein. KEY WORDS: JC virus; VP3 protein; prokaryotic expression JC病毒属人类多瘤病毒，是一种机会感染性病原，在正常人群中其血清学阳性率高达80%。1971年PADGETT等1首先在人类的一种神经胶质细胞脱髓鞘病变(进行性多灶性脑白质病，progressive multifocal lukoenphalapathy, PML)患者的病灶中发现并分离出JC病毒，该病毒具有明显的嗜神经性特点,有致瘤性，而且与某些类型的脑瘤有关。目前普遍认为，儿童期的JC病毒的感染率可能高达65%，因为多无明显的症状，故不会引起人们的注意2。JC病毒具体的传播途径目前尚不清楚。大多数研究认为该病是经粪口途径传播的3，但是也有人认为其是母婴传播4。虽然多数人可能从幼年已经开始感染该病原，但是只有免疫严重缺陷的患者发病，尤其是细胞免疫缺陷的患者2。研究发现，JC病毒编码包括VP3在内的有6种蛋白，但其功能尚不清楚5。为了进一步研究JC病毒的生物学功能，我们构建了JC病毒的VP3原核表达载体，观察重组VP3蛋白在大肠杆菌中的表达。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 材料 菌株、载体、大肠杆菌DH5、大肠埃希菌BL21及原核表达载体pET32a(+)为本室保存；扩增JC病毒VP3基因的材料人免疫缺陷病毒(HIV)感染者的脑脊液从本院获取；pGEMT载体购于Promega公司。 1.1.2 主要试剂 Taq酶购于鼎国生物公司；丙烯酰胺、N，N亚甲双丙烯酰胺、T4 DNA连接酶、IPTG购于Promega公司；玻璃奶回收试剂盒购自博大泰克公司；BamH、Aval购自TaKaRa(大连)公司；抗His单克隆抗体购自Santa Cruz公司；HRP标记羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物公司；化学发光底物购自Pierce公司；PVDF膜购自Millipore公司；其余化学试剂均为国产分析纯和生化试剂。引物合成及DNA测序由Invitrogen公司完成。 1.2 方法 1.2.1 VP3基因的扩增 根据VP3基因序列，在编码区的上游和下游设计合成一对寡聚核苷酸引物(P1：5CGGGATCCATGGCTTTACAATTATTTAATC3； P2：5CCGCTCGAGACTTCTAGAACTTCTACTCC TC3)，引物两端分别引入BamH和Aval酶切位点。以HIV患者来源的脑脊液为模板，经PCR扩增获得VP3全长序列。反应条件：95 5min，94 45s、58 45s、72 45s35循环，72延伸7min，4。10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果，切胶玻璃奶法纯化回收。 1.2.2 重组表达质粒pET32a(+)VP3的构建 将纯化回收的目的基因片段与pGEMT载体16条件下T4 DNA连接酶连接过夜，转化入大肠杆菌DH5感受态细胞，铺于含有氨苄青霉素的LB的平板上37孵育16h。挑取白色菌落行菌落PCR，碱裂解法提取阳性克隆质粒并进行BamH/Aval双酶切鉴定，证明目的基因片段已插入pGEMT载体中后，送生物公司测序。测序显示正确后用BamH/Aval从pGEMT克隆质粒上酶切目的基因片段，10g/L琼脂糖凝胶电泳纯化回收，与经BamH/Aval酶切的pET32a(+)表达质粒连接。连接产物转化表达菌株大肠埃希菌BL21，平板于37孵育过夜后进行菌落PCR，阳性菌落扩增菌摇菌提质粒并用BamH/Aval双酶切质粒鉴定。 1.2.3 VP3重组蛋白的表达 挑取单个新鲜阳性克隆及pET32a(+)空载体克隆接种于含有羧苄青霉素(终质量浓度为100mg/L)的LB培养基中，37培养过夜。按1100扩大、37培养至菌吸光度为A600=0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养2.5、3.5、4.5h，取3mL离心集菌，100L 1mol/L TrisCl(pH 6.8)重悬细菌沉淀，加入100L 2SDS凝胶加样缓冲液及5L 巯基乙醇，煮沸10min，1000g高速离心5min后取20L进行SDSPAGE电泳分析。 1.2.4 VP3重组蛋白的抗原性检测Western blot分析 将经过SDSPAGE分析的聚丙烯酰胺凝胶切下带有pET32a(+)VP3诱导菌株和带有空pET32a(+)载体的诱导菌株泳道的凝胶进行转移电泳。50g/L脂奶粉4封闭过夜，用1200稀释的His抗体作为第一结合抗体反应4h；再用12500稀释的HRP标记羊抗鼠IgG孵育1h；加入显色液，X光片曝光。 2期2李小权，毛 羽，郑铁龙，等. JC病毒蛋白VP3原核表达载体的构建及诱导表达 2 结 果 2.1 VP3基因的PCR扩增 PCR扩增VP3基因片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增的基因片段大小与预期相同，且无非特异性扩增现象(图1)。 2.2 pET32a(+)/VP3重组质粒的构建 PCR扩增产物纯化回收后连接pGEMT载体，经测序及BamH/Aval双酶切鉴定正确后，插入表达载体pET32a(+)相应酶切位点上，经转化、提质粒后BamH/Aval行双酶切鉴定，结果表明重组表达载体pET32a(+)VP3构建成功(图2、图3)。 2.3 VP3重组蛋白的表达和Western blot免疫印迹分析 将经过诱导和未诱导的大肠杆菌BL21，进行SDSPAGE和Western免疫印迹分析。结果显示，经过诱导的大肠杆菌BL21Western免疫印迹分析可见明显条带且无杂带(图4、图5)。 3 讨 论 JC病毒属人类多瘤病毒，与人类多种肿瘤的发生以及PML病密切相关。随着免疫抑制患者的增多，探讨JC病毒的致病机理就显得尤为重要。 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法，一般称为原核表达6。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。作为研究最为详尽的原核细菌，大肠杆菌用于重组蛋白的表达具有易于生长和控制的特点，用于细菌培养的材料便宜，而且有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。本研究中采用的原核表达载体pET32a(+)，含有T7启动子和转录终止信号，除了能够编码6个组氨酸残基外，还带有大肠杆菌TrxA基因。外源基因经多克隆位点插入后与TrxA及His标签一起融合表达，不仅提高了表达产物的稳定性，而且由于分子质量增大，经SDSPAGE分析时更容易鉴定。尤其重要的一点是，载体上带有的His标签可以使重组蛋白与Ni柱螯合，利于大量表达后的亲和层析。 VP3是JC病毒编码的6个蛋白中的一个重要的包膜蛋白，全长678bp，编码225个氨基酸序列，在病毒的装配、传播及与细胞的相互作用中有着多种生物学功能。通过定点突变发现，VP3突变株比野生株的传播能力明显降低，VP3缺乏会导致病毒不能正确地装备和细胞定位78。因此，要研究JC病毒，VP3蛋白的研究就显的极其重要。 在本实验中，我们着眼于VP3原核表达系统的建立，成功地从人类免疫缺陷疾病患者脑脊液中克隆了VP3基因，构建了pET32a(+)/VP3原核表达载体，并在大肠埃希菌BL21中经IPTG诱导下获得高效表达。随后分别以His单克隆抗体与羊抗鼠HRPIgG为一抗和二抗进行Western blot检测，验证了其正确性。制备目的蛋白的多克隆或单克隆抗体是深入探索基因功能的重要前提。本研究是进一步研究VP3生物学意义的前提和基础，今后我们将制备VP3抗体，为研究其临床意义提供有效手段。【参考文献】 1CO JK, VERMA S, GURJAV U, et al. Interferon alpha andbeta restrict polyomavirus JC replication in primary human fetal glial cells: implications for progressive multifocal leukoencephalopathy therapy J. J Infect Dis, 2007, 196(5):712718.2MAO YS, LU CZ, WANG X, et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in Lewis rats by a viral peptide with limited homology to myelin basic protein J. Exp Neurol, 2007, 206(2):231239.3BROFILLMAS S, CLEMENTECASARES P, MAJOR EO, et al. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission J. J Neurovirol, 2003, 9:498507.4KUNITAKE T, KITAMURA T, GUO J, et al. Parenttochild transmission is relatively common in the spread of the human polyomavirus JV virus J. J Clin Microbiol, 1995, 33(6):14481451.5OKADA T, ENDO S, TAKAHASHI H, et al. Distribution and function of JCV agnoprotein J. J Neurovirol, 2001, 7(4):302306.6安润，楚雍烈，杨娥，等. 丙型肝炎非结构蛋白3全长基因的克隆与表达 J. 西安交通大学学报(医学版), 2006, 27(5):449451.7GASPAROVIC ML, GEE GV, ATWOOD WJ. JC virus minor capsid proteins Vp2 and