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P糖蛋白在乳腺癌原发性耐药过程中的表达 作者：赵菲，姜军，范林军，杨新华，张毅【关键词】 基因 Pglycoprotein expression in the development of primary multidrug resistance in breast carcinoma【Abstract】 AIM: To study the expression and significance of Pglycoprotein (Pgp) in the development of multidrug resistance in breast cancer. METHODS: The expression of Pgp and MDR1 mRNA were detected by immunohistochemistry and reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) in the specimens from 25 breast cancer patients with neoadjuvant chemotherapy (NAC group), 15 breast cancer patients without neoadjuvant chemotherapy (nonNAC group) and 10 patients with breast adenosis (control group). RESULTS: The positive rate of Pgp expression was 84.0%（21/25）, 46.7%（7/15）and 0 in NAC group, nonNAC group and control group, respectively. MDR1 mRNA expression was 84.0%（21/25）, 53.3%（8/15）and 10%（1/10） in three groups respectively. Significant difference was found between the three groups (P<0.01). CONCLUSION: Some tumor cells tolerances to chemotherapeutics increase during the process of oncogenesis and the tolerances can be induced by an extremely low expression of MDR1/Pgp. MDR1/Pgp is associated with the intrinsic multidrug resistance in breast carcinoma.【Keywords】 Pglycoprotein; genes, MDR; breast neoplasms【摘要】目的：研究乳腺癌原发性耐药过程中P糖蛋白（Pglycoprotein, Pgp）的表达特征，初步探讨乳腺癌原发性耐药的发生机制. 方法： 采用免疫组织化学及逆转录多聚酶链反应技术，对25例接受术前新辅助化疗的乳腺癌患者、15例未接受术前化疗的乳腺癌患者、10例乳腺腺病患者组织标本内Pgp 和MDR1 mRNA的表达情况进行检测. 结果： Pgp表达阳性率在乳腺癌术前化疗组患者和未化疗组患者中分别为84.0%（21/25）和46.7%（7/15），对照组未见Pgp表达； MDR1表达阳性率在三组则分别为84.0%（21/25）、53.3%（8/15）和10%（1/10），组间差异均显著（P0.01）. 结论：部分乳腺癌细胞在恶性变的过程中同时伴有对化疗药物耐受能力的增加，肿瘤细胞内极低水平的MDR1 mRNA表达即可导致多药耐药，MDR1/Pgp与乳腺癌的内源性耐药相关.【关键词】P糖蛋白；基因，MDR；乳腺肿瘤0引言多药耐药（multidrug resistance, MDR）是肿瘤治疗失败的重要原因. 目前对MDR的研究主要集中于肿瘤细胞在化疗药物诱导下所产生的获得性耐药，对内源性耐药机制的研究则尚欠深入. 而在临床治疗中，若预先了解肿瘤细胞的内源性耐药状况，不仅可以避免因使用MDR型药物而导致的获得性多药耐药，而且可以针对肿瘤的耐药特点使用逆转剂，提高化疗效果. 我们通过免疫组化方法及RTPCR法检测P糖蛋白（Pglycoprotein, Pgp）及其编码基因MDR1（multidrug resistance 1）在乳腺癌原发性耐药过程中的表达.1材料和方法1.1材料200302/200310住院女性乳腺癌患者接受术前化疗者25例（术前化疗组），未行术前化疗者15例（术前未化疗组），乳腺腺病手术患者10例（对照组）. 3组患者年龄无显著差异，组间均衡性好. 取材后标本直接置于液氮中冻存备用. 采用福州迈新生物技术开发公司的免疫组化染色试剂盒与即用型抗Pgp mAb.1.2方法按说明书进行. Pgp以胞质和胞膜呈棕黄色着色为阳性，染色强度与阳性细胞的百分比乘积>3分为免疫反应（+）. 采用Roche公司的Tripure试剂提取组织总RNA. 获得的RNA行琼脂糖凝胶电泳见清晰的28 S, 18 S rRNA条带；紫外分光光度仪测定其260 nm及280 nm的A值比值>1.65，证实样本无污染. RNA浓度=A26037500 mg/L. RTPCR采用两步法，逆转录反应体系： 5缓冲液5.0 L， 10 mmol/L dNTP 1.25 L， 40 MU/L Rnasin 0.625 L， 200 MU/L MMlV逆转录酶1.0 L，加DEPC去离子水至总体积25 L，PCR仪上42逆转录60 min, 99 5 min灭活逆转录酶；PCR反应体系： 逆转录产物10 L，10缓冲液5.0 L，25 mmol/L MgCl2 8 L， 2.5 mmol/L dNTP 4 L， 5 MU/L Taq酶0.25 L， 20 mol/L上下游引物各0.5 L，并设actin为内参，加DEPC去离子水至总体积50 L. 引物序列如下： MDR1： 上游5GTTGCCATTGACTGAAAGAAC3，下游5 ACAGGAGATAGGCTGGTTTGA3；actin：上游5CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC3，下游5AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGA3. 反应条件：开始94 5 min充分变性，而后变性94 45 s，退火59 50 s，延伸72 90 s，30个循环，最后72延伸10 min. 取PCR产物10 L，加入含溴酚蓝的上样缓冲液1 L，于1.5 g/L琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下照相并保存. 凝胶照相后，于Gel Doc 2000凝胶图像分析系统进行扫描，用Quantity one Version 4.0软件分析. 测定产物条带的积分吸光度（integral absorbance, IA）后计算相对吸光度（relative absorbance, RA），RAIA目的片段/IAactin，代表各产物的相对含量，即各目的片段mRNA在组织内稳态水平的高低.统计学分析： 采用SPSS11.0软件进行. 本资料为偏态分布，率的比较采用Fisher精确检验，3组间RA的比较采用非参数秩和检验（KruskalWallis检验），P<0.05为有统计学意义. 2结果Pgp的表达率，在化疗组、非化疗组和对照3组间差异显著（84.0%, 46.7%, 0.0%, P<0.01, Fig 13）. RA及MDR1基因扩增率，3组间差异显著（Tab 1, P<0.01, Fig 46）.表1乳腺癌组织MDR1mRNA表达（略）3讨论P糖蛋白是第一个被发现与肿瘤MDR相关的ATP结合盒超家族成员，其在正常乳腺组织中不表达，在乳腺癌组织中则表达水平升高，且Pgp的过度表达并非肿瘤细胞的特性，而是在肿瘤组织和瘤周正常组织中均可见的普遍现象. 肿瘤细胞中Pgp的表达可使细胞在MDR型药物诱导下产生多药耐药性，因此，其表达水平也可能成为临床化疗中一个有用的预测指标1, 2.本研究采用免疫组化及RTPCR方法，进行蛋白的定位和基因的半定量检测. 在乳腺癌患者术前化疗组中，Pgp蛋白与MDR1基因的表达率均为84.0% （21/25），与多数文献报道结果相符3,4； 在未接受术前化疗的乳腺癌患者中，二者的表达率则分别为46.7%（7/15）和53.3%（8/15），基因扩增水平高于蛋白表达，二者虽然高度相关，但并不完全相符，其中，有4例患者有MDR1基因扩增而无Pgp蛋白的表达，3例患者有蛋白的表达而无基因扩增；在10例对照组标本中，1例可见极弱的MDR1基因条带，而Pgp蛋白的表达则为阴性. 因此，MDR1基因的扩增并非总是能够导致蛋白产物的过度表达，而蛋白产物的过度表达亦并非一定由基因扩增引起. 对于人类乳腺癌MDR细胞系的研究表明，MDR1基因的表达调控可发生在DNA, RNA和蛋白质等各级水平，如细胞中Ybox转录调节因子YB1的过度表达及核定位与MDR1表达上调有关5；ras基因6和突变型p537可激活MDR1基因转录，使Pgp表达增高；Pgp蛋白在翻译后水平的糖基化8和磷酸化9,10修饰则对维持其功能十分重要.对MDR1基因的RTPCR半定量检测结果显示，术前化疗组、未化疗组及对照组患者中MDR1的平均相对密度分别为0.63, 0.22和0.03，两两比较差异显著（P<0.01）. 上述结果支持化疗可诱导MDR1/Pgp表达的观点，与既往研究结果一致；而未化疗组与对照组的研究结果则显示，部分乳腺癌患者在接触化疗药物之前即出现MDR1/Pgp的表达增高，说明乳腺组织细胞在恶性变的过程中同时伴有对化疗药物耐受能力的增加，MDR1/Pgp与乳腺癌的内源性耐药相关. 以往研究证实，肿瘤细胞内极低水平的MDR1 mRNA表达即可导致多药耐药11,12；MDR的遗传学基础13业已证明，肿瘤细胞在增殖过程中有较为固定的突变频率，每次突变均可导致耐药性瘤株的出现. 但是，肿瘤细胞的突变是如何发生的、MDR1基因在突变过程中的作用及其机制等问题仍需进一步的研究. 【参考文献】1 Sun J, He ZG, Cheng G, et al. 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