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RECK在宫颈癌中的表达及意义 作者：王玲 韩丽英 王强 李荷莲【摘要】 目的 检测基质金属蛋白酶抑制剂RECK在宫颈癌组织中的表达，探讨其对血管生成的影响。方法 实验组(宫颈癌组织)26例以及对照组(正常宫颈上皮、慢性宫颈炎组织)24例，应用SP免疫组化法，经细胞计数及灰度测量检测RECK的表达，计数微血管密度(MVD)的值。比较二者的差异性。结果 RECK的表达在实验组的灰度值(7 848.741 276.04)明显低于对照组(657 282.830 681.16)(P<0.05);RECK在宫颈癌中表达与肌层浸润深度、盆腔淋巴结转移有关(P<0.05)，而与临床分期、组织学分型、组织学分级、脉管浸润无关(P>0.05)。MVD值在实验组(19.461 53.071 8)明显高于对照组(12.000 02.662 9)(P<0.05);二者呈负相关关系，r=-0.397,P=0.049 5。结论 RECK在宫颈癌组织中低表达;REKC的高表达能抑制宫颈癌肿瘤血管生成。 【关键词】 RECK; 基质金属蛋白酶; 宫颈癌; 微血管密度恶性肿瘤侵袭正常组织及转移必须突破细胞外基质(ECM)尤其是基底膜屏障。而基质金属蛋白酶(MMP)在ECM及基底膜的降解过程中起到主导作用，能够促进肿瘤的侵袭转移和血管生成。MMP抑制剂作为肿瘤治疗的新药物早已引起人们的重视。RECK (reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs) 基因是近年来发现的新型MMP抑制剂，其转录后水平抑制MMP特别是MMP2、MMP9以及膜型基质金属蛋白酶(MT1MMP /MMP14)的表达与活性，主要抑制肿瘤的血管生成以及侵袭转移1。国内外学者通过对乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等组织的体外实验研究表明：在恶性肿瘤组织中，RECK的表达显著降低，并与肿瘤及淋巴转移有关;但对RECK与肿瘤的分期及分化程度关系意见不一致2，3。本实验主要探讨RECK在宫颈癌中的表达情况，及与宫颈癌发展、侵袭及转移的关系以及对血管生成的作用，为宫颈癌的基因靶向治疗建立一个新的起点。1 资料与方法1.1 标本来源 选择2007年3月2008年3月在吉林大学第二医院、吉林大学第一院、长春市妇产医院、省肿瘤医院进行手术治疗的50例患者的宫颈组织。分为试验组及对照组。试验组26例：经病理组织证实为宫颈癌，术前患者均未行放疗、化疗和免疫治疗，年龄3372岁，平均年龄(486.52)岁。其中期19例，a期4例，b期2例，a期经2个疗程化疗后1例;高分化9例，中分化13例，低分化4例;鳞癌21例，腺癌4例，腺鳞癌1例;盆腔淋巴结转移2例;脉管转移2例。对照组24例，包括癌旁组织16例、慢性宫颈炎8例。两组在年龄上无统计学差异。1.2 试剂 鼠抗人RECK蛋白多克隆抗体购自美国Santa Cruz生物制品公司，鼠抗人因子单克隆抗体购自福州迈新生物技术有限公司，其他试剂采用进口或国产分析纯试剂。1.3 方法1.3.1 标本采集 广泛性子宫切除或全子宫切除标本，立即用4预冷双刃刀片从宫颈组织上切取1 cm3大小组织，投入10%甲醛溶液中，4保存，供制备光镜标本用。组织经固定、脱水、包埋、5 m连续切片。1.3.2 实验方法 将切片进行HE染色和SP免疫组化。用Imagepro plus 6.0做灰度分析(IOD)，半定量计量RECK阳性率及IOD值，计数MVD值。1.3.3 结果判定 RECK细胞计数判断标准：400倍镜下观察，在肿瘤细胞膜和/或细胞质有黄棕色或玫瑰红色颗粒沉着为RECK阳性染色。根据染色程度和染色细胞百分率进行评分：基本不着色为0分，淡为1分，适中为2分，深为3分;着色细胞占计数细胞百分率5%为0分，6%25%为1分，26%50%为2分，51%为3分。将平均着色程度得分与平均着色细胞百分率得分相乘为其最后得分：1分为阴性(-)，23分为(+)，46分为()，>6分为()。MVD计数结果判定标准：细胞间质内孤立的棕黄色血管内皮细胞或细胞簇或血管腔内径小于8个红细胞直径且管壁无肌层者代表1条单独的微血管。先在低倍(100)视野下找到肿瘤组织内微血管密度最高的区域(热点)，然后在高倍(400)视野下计数5个视野的微血管数，取其平均值。1.4 统计学方法 使用SPSS11.0进行数据分析，RECK检测结果细胞计数以(-)表示，灰度分析以IOD均值及标准差表示，MVD结果以均值及标准差表示。组间进行独立样本2检验、t检验及双变量相关性分析。2 结 果2.1 宫颈癌组织及对照组中RECK的表达 RECK在胞浆和胞膜处表达明显，宫颈间质中有适度表达，呈广泛性弥漫(见图1)。RECK在宫颈癌组织中阳性表达11例(42.31%)，而在对照组中呈高表达，阳性表达22例(91.67%)，组间比较有显著性差异(P=0.000 2)。26例宫颈癌组织IOD为7 848.741 276.04，24例对照组为657 282.830 681.16，经t检验，宫颈癌组IOD值低于对照组，差异有统计学意义(t=2.570 5，P=0.000)(见表1)。两种方法检验结果一致。2.2 宫颈癌组织中RECK表达与肌层浸润和淋巴结转移的关系 经组间2检验，RECK在宫颈癌中表达与肌层浸润深度、盆腔淋巴结转移有关(P<0.05)，而与FIGO分期、组织学分级和组织学分型无关(P>0.05)。深肌层间质浸润、有盆腔淋巴结转移者，其RECK阳性表达率分别显著低于浅肌层浸润、无盆腔淋巴结转移者(P=0.018 4;P=0.023 7)。不同病理参数下RECK表达见表2。表1 两组RECK的表达表2 RECK的表达与宫颈癌临床病理参数的关系2.3 宫颈癌MVD的表达情况及与RECK的相关性分析 镜下观察血管染色结果，在宫颈癌组织中，微血管排列紊乱，着色不均一，大小不等，形状不规则，血管壁厚度不均(见图2)，而对照组中血管内皮细胞表达较清晰，形状规则，呈圆形或椭圆形，管壁厚度均匀。宫颈癌组中MVD明显高于对照组(P=0.000 0)。经线性回归分析，26例宫颈癌组织RECK表达与MVD值呈负相关(r=-0.397,P=0.049 5)(见表3)。表3 宫颈癌和对照组中MVD的表达及与REOK的相关性分析3 讨 论RECK基因是由日本学者Chiaki Takahashi等人在转染了vKiRas基因的NIH3T3细胞系表达的cDNA中分离出来的转录抑制基因。在正常组织或无肿瘤细胞系中广泛表达，而在癌基因转染的成纤维细胞或肿瘤细胞中低表达或无表达。RECK在转录后水平抑制MMP(特别是MMP2、MMP9、MT1MMP)的分泌与活性，还可以抑制proMMP9和proMMP2从细胞内的释放，从而抑制肿瘤的血管生成、浸润和转移4。RECK在正常组织中高表达，而在各种肿瘤来源的细胞系及转染了Ras等癌基因的细胞中不表达。本研究表明，RECK表达呈弥散状，呈棕黄色或棕褐色颗粒样物质，主要分布在胞膜和/或胞浆中，部分标本可见间质内表达。在对照组中，RECK呈高表达，而在宫颈癌组织中RECK的阳性表达率显著降低(p=0.0002)。这与国内外报道相符。癌基因HER2/neu可以抑制RECK的表达，说明RECK可能是癌基因作用的靶位点5。Cho2利用DNA甲基转移酶抑制剂(DNMT)5氮胞苷作用于被甲基化的RECK，恢复其化学结构，结果RECK表达上调。说明癌组织中RECK被甲基化从而表达降低。Rabien等指出RECK在前列腺癌中的表达明显低于前列腺增生组织6。Song 等3证实胃癌组织中RECK的表达与肿瘤的镜下生长(P=0.018)、淋巴浸润(P=0.018)、淋巴结转移(P=0.000)相关，随肿瘤侵袭能力增强而表达下降。本研究发现，RECK基因的表达与宫颈癌FIGO临床分期、组织学分级、组织学分型、患者年龄无关，与癌组织肌层间质浸润深度、盆腔淋巴结转移相关。浸润深度累及深肌层或更深、盆腔淋巴结转移阳性组，RECK表达明显下降(P=0.018这4,P=0.023 7)。Oh等4用携带RECK基因的载体转染HT 1080人纤维肉瘤细胞并将其接种到裸鼠体内，发现肿瘤中血管密度降低，血管出芽受到抑制，血管腔增大。基因敲除研究发现，RECK基因的适量表达可以抑制血管的生成。研究表明，RECK作用的过程在于血管的成熟过程，而不是血管生成过程。有研究表明，TIMP2和Ala+TIMP2通过增强RECK表达介导的时间依赖机制抑制基质微血管上皮细胞(hMVEC)的迁移。TIMP2加强了Crk和C3G之间的信号传导，导致Rap1基因活性增加，与Rap1表达不活跃的细胞株相比，hMVEC稳定表达。说明TIMP2、Ala+TIMP2、Rap1基因能上调RECK的表达，使血管迁移减少7。本研究表明，RECK 表达阳性组织中微血管结构清晰，管腔增大且形状规则，呈椭圆或圆形，着色较深。而宫颈癌组织的微血管管壁菲薄且着色不均，管腔狭小且形状不规则;宫颈癌组织中MVD值明显高于对照组，相关性分析表明MVD值与RECK表达呈负相关说明RECK的表达可以抑制肿瘤血管的生成，与国外报道相似。总之，本研究表明宫颈癌组织中RECK的表达水平显著降低，RECK低表达的肿瘤具有更强的侵袭和淋巴转移能力，其表达与宫颈癌MVD有密切关系，故二者可望成为早期诊断宫颈癌及判断预后新的指标。对RECK基因的深入研究不但有利于更进一步了解肿瘤的生物学行为，还可以为研究抗肿瘤药物提供新的思路。【参考文献】 1 Toshimichi A，Mitsuhiro T，Cheng SQ,et al.Prognostic values of matrix metalloproteinase family expression in human colorectal carcinomaJ. Surg Res，2008;146(1)：32422 Cho CY，Wang JH，Chang HC,et al.Epigenetic inactivation of the metastasis suppressor RECK enhances invasion of human colon cancer cellsJ. Cell Physical，2007;213(1):659.3 Sang YS，Hee JS，Nam E,et al.Expression of reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs (RECK) as a prognostic indicator in gastric cancerJ.Eur Cancer，2006;42:1018.4 Oh J,Takahashi R，Kondo S,et al.The membraneanchored MMP inhibitor RECK is a key regulator of extracellular matrix integrity and angiogenesisJ.Cell，2001;107:789800.5 Hsu MC，Chang HC，Hung WC,et al.HER2/neu represses the metastasis suppressor RECK via ERK and Sp transcription factors to promote cell invasionJ.Biol Chem，2006;281(8):471825.6 Rabien，Ergun，Lein M,et al.The matrix metalloproteinase