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一种新的肿瘤标志物LyGDI在卵巢癌中的表达 作者：甄红英 王淑玲 吴后男 张小为【摘要】 目的 确定LyGDI是一种新的卵巢恶性肿瘤标志物。 方法 将受试人群分为卵巢癌、良性卵巢疾病和正常人群组， ELISA技术检测各组人群血清中LyGDI的蛋白表达水平，并通过组织免疫化学技术验证lyGDI的表达。 结果 血清中lyGDI水平的平均值和中位数在卵巢癌患者为3.10 mg/L和2.31 mg/L，明显高于良性卵巢疾病人群1.10 mg/L和0.97 mg/L(P<0.05)及正常人1.17 mg/L 和0.55 mg/L(P<0.001)，良性卵巢疾病和正常人群组比较，差异无统计学意义;组织化学染色，lyGDI在卵巢癌组织中高表达，在良性卵巢组织中不表达。 结论 lyGDI在卵巢癌中可作为一种新的肿瘤标志物。 【关键词】 肿瘤标志物;卵巢癌;lyGDI【Abstract】 Objective To verify if lyGDI is a novel serum biomarker for ovarian carcinoma.MethodsSerum lyGDI was measured by enzymelinked immunosorbent assay for 76 healthy control, 26 patients subsequently diagnosed with ovarian cancer and 12 patients suffered from benign ovarian disease. Intracellular distribution of lyGDI was assessed by immunohistochemistry in benign and malignant ovarian disease. ResultsSerum lyGDI level was significantly elevated among ovarian cancer cases than among benign disease and healthy controls (P<0.001). Immunohistochemical analysis demonstrated lyGDI were highly expressed in cancer cells and also found stromal lymphocytes, whereas it is only scattered in stromal lymphocytes in benign ovarian disorders.ConclusionLyGDI may display a novel biomark for screening ovarian cancer. Its distribution in tumor tissue implies it may play an important role in cancinogenesis.【Key words】 Tumor biomark; Ovarian Cancer; LyGDI卵巢癌是妇科最常见的肿瘤之一，其死亡率位居妇科恶性肿瘤之首。由于早期缺乏可靠的诊断标志物，75 %患者被诊断为卵巢癌时，肿瘤已扩展至卵巢外，为临床III或IV期，导致不良预后，她们的5年存活率仅为5 %20 %1。如果恶性肿瘤只是局限于卵巢，通过外科手术，5年存活率的患者可达到89 %95 % 1。因此，发展以血清学为基础的筛选方法，对于实现卵巢癌的早期诊断具有较好的应用价值。CA125是最早发现和最广泛应用于临床诊断卵巢癌的肿瘤抗原2。作为卵巢癌的血清标志物，其主要问题是特异性和敏感性较低，特别是对于I/II期的卵巢癌，只有40 %50 %的患者表现为CA125血清水平提高3。此外，良性卵巢疾病和其他肿瘤患者也可表现为血清CA125增高。癌胚抗原153(carcinogenic antigen 153，CA153)，溶血磷脂酸 (lysophosphatidic acid，LPA)和壳多糖酶蛋白家族的糖蛋白(YKL40)也被确定为卵巢癌的肿瘤标志物46，临床上也常用CA153作为诊断的参考依据。Rho蛋白属于具有小GTP酶活性的ras相关蛋白家族，由Rho, Rac和CDC42亚家族构成。这些蛋白涉及到细胞生物功能的多个方面，包括生长和分化、囊泡转运、凋亡、迁移、细胞骨架组装和去组装及细胞极性7。Rho蛋白与GDP结合时为失活状态，与GTP结合时为激活状态，不断地进行转换。Rho鸟氨酸解离抑制因子(Rho guanine nucleotide dissociation inhibitor, RhoGDIs)家族包括：RhoGDI、RhoGDI (LyGDI) 和RhoGDI (RhoGDI3)3个成员，其功能为调控Rho蛋白失活和激活状态的2种形式转换8。近年来，已有文献报道RhoGDI与肿瘤的发生有关，RhoGDI过度表达于多种肿瘤如恶性胶质瘤9、胃癌10和肺癌11等肿瘤中。LyGDI由于最初从造血组织中的B和T淋巴细胞中克隆和表达出来而得名12，蛋白质组学和DNA芯片研究报道，在卵巢癌中lyGDIs呈现高表达13, 14，但在患者血清学中并未得到验证。本研究的目的是确定lyGDI作为卵巢癌中一种新的肿瘤标志物。对象与方法一、对象38名卵巢肿瘤患者来源于北京大学第三临床医院妇产科，通过标准的妇科和超声波检查予以诊断，手术后，病理诊断26名卵巢癌，12名良性卵巢疾病，都排除其它部位的肿瘤;76名健康女性对照来源于北京大学医学部校医院体检人群，未发现妇科及其它部位的肿瘤。二、方法1.血清和组织的收集：血清样本在室温凝集3090 min，转速1500 r/min于4 离心15 min，血清分装后于-70 贮存，直至测试。卵巢肿瘤患者的组织切片固定于10 %的甲醛中并石蜡包埋，H&E染色用于组织学诊断。2.酶联免疫吸附(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)法 血清中lyGDI水平的测定采用双抗体三明治夹心法，多克隆兔抗人和羊抗人(购于Santa Cruz公司)lyGDI抗体分别用作捕获和检测抗体。50 l捕获抗体(1400稀释于0.05 M的Na2CO3包被液)用于包被96孔酶标板， 4 过夜。于室温用250 l的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)和3 %牛血清白蛋白(beef serum albumin,BSA)封闭3 h，50 l不同浓度的重组人的lyGDI蛋白加入到各孔中，室温孵育20 h后，洗板3次，并将100 l检测抗体稀释(1500)于0.05 % PBST(0.05 % Tween20 / PBS)缓冲液中，室温3 h;洗板3次后，加入100 l/孔购于R&D公司辣根过氧化酶标记的抗羊抗体(15 000)，室温摇动孵育2 h。洗板3次后，在避光处加入100 l底物液/孔(0.015 % H2O2, 2.5 g/L邻苯二胺(ophenylenediamine,OPD)，孵育30 min。最后加入100 l H2SO4.终止反应，酶标仪测定吸光值后计算浓度。所有样品为双孔平行。3.免疫组化染色：免疫组织化学染色用于评价在卵巢癌和良性卵巢肿物组织切片中lyGDI的分布。甲醛固定和石蜡包埋的5 m厚度的切片，脱蜡和水，然后用3 % H2O2,和5 %牛血清白蛋白处理后，加入第一抗体(1500多克隆兔抗人的lyGDI)于切片中，孵育1 h后，PBS洗片3次，加入生物素标记的羊抗兔IgG(11000);孵育30 min后，加入生物素标记辣根过氧化酶孵育30 min。用DAB过氧化物底物显色切片，苏木精复染。4.统计学处理：将所有数据应用SPSS13.0软件进行处理，把lyGDI的数值经对数转换后， Oneway ANOVA检验用于各组间的比较。所有检验P<0.05为差异有统计学意义。结 果一、卵巢癌、良性卵巢疾患和正常人血清中lyGDI水平卵巢癌组lyGDI水平高于良性卵巢疾患和正常人群组相，中位数为卵巢良性疾患和健康对照组的4.17倍和2.4倍，差异均有统计学意义(P=0.009 和P=0.000)，见表1和图1，良性卵巢疾患和健康对照组之间，差异无统计学意义(P=0.189)。表1 正常人群，良性卵巢疾病和卵巢癌中血清lyGDI 水平二、卵巢组织中的lyGDI的染色在良性卵巢肿物中，lyGDI只是散在的分布于基质的淋巴细胞中，在卵巢上皮细胞及包括成纤维细胞和内皮细胞的基质细胞中未见，见图2A。在卵巢癌组织中，lyGDI在大部分肿瘤细胞中呈中度或高度表达，也可在基质中的淋巴细胞中表达。肿瘤细胞中的信号主要分布在胞浆中，偶见于核内，见图2B。图2免疫组织化学染色 LyGDI在良性卵巢腺瘤(A)和卵巢癌(B)中的表达(A和B，10,插入部分，40)A LyGDI在良性腺瘤上皮不表达;B 在卵巢癌细胞中表达讨 论Rho蛋白属于小G蛋白。作为一种分子开关，Rho在细胞信号传导通路中起着重要作用。多种细胞外信号可激活Rho蛋白家族成员，其主要的生物学功能是通过引起肌动蛋白细丝等细胞骨架蛋白的组装及去组装，从而维持细胞的形态极性，促进细胞的变形、趋化运动和游走，此外Rho家族成员也参与对细胞周期的调控，细胞应激反应的调节等15。近年来已发现，Rho蛋白的多种功能与肿瘤的发生发展及转移相关。LyGDI(RhoGDI2)参与调控Rho蛋白的小GTP酶循环，并与多种恶性肿瘤的生成相关。cDNA芯片结果显示，lyGDI的基因表达在浆液性卵巢癌中明显高于良性浆液性卵巢腺瘤13;蛋白组学分析表明，lyGDI蛋白过度表达于浸润的卵巢癌14。这些结果提示，过度表达的lyGDI在用于卵巢癌的检测和治疗靶点方面是一种潜在的标志物。本研究评价卵巢癌、良性卵巢肿物和正常人群3组血清中lyGDI的表达水平，其中，卵巢癌组lyGDI的表达水平显著高于良性卵巢组(P=0.009)和健康人群组(P=0.000)，表明lyGDI极有可能成为卵巢癌筛查过程中的一种新的肿瘤标志物，此结果与Tapper 等13人和Jones 等14人分别报道的在卵巢癌中lyGDI的mRNA表达水平上调及过度表达lyGDI的蛋白的结果相一致。免疫组织化学染色结果进一步确定lyGDI表达于卵巢癌细胞，但在良性疾患的卵巢上皮细胞中不表达。这些结果表明，lyGDI作为一种新的肿瘤标志物表达于卵巢癌中。本研究中良性卵巢疾病的样本数相对较少，可能与真实分布情况有误差，对于其临床应用价值需要通过扩大样本量做进一步研究。【参考文献】 1Kurman RJ, Visvanathan K, Roden R, et al. 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