两型星形胶质细胞基因表达谱差异的初步观察.doc

两型星形胶质细胞基因表达谱差异的初步观察 作者：严美娟 万明辉 李春鹏 夏春林【摘要】 目的：研究不同型别星形胶质细胞的基因表达谱，比较1型和2型星形胶质细胞基因表达谱之间的差异，以进一步研究两者的生物学特性及其功能。方法：原代培养新生SD大鼠大脑皮质混合胶质细胞，经振荡和差速消化纯化培养1型星形胶质细胞（T1A）和2型星形胶质细胞（T2A）；应用基因芯片技术获取T1A和T2A的基因表达谱，并对两者的基因表达谱进行初步分析。结果：基因芯片上检测点4096个，共有差异表达基因267条，其中113条在T1A中高表达，154条在T2A中高表达。结论：本实验获得大鼠大脑T1A和T2A的基因表达谱，首次报道267条存在于T1A和T2A之间的差异表达基因。 【关键词】 星形胶质细胞；细胞谱系；基因表达谱；基因芯片随着研究的不断深入，人们已认识到胶质细胞不仅对神经元有支持、分隔绝缘、形成髓鞘、营养、修复和再生等多种功能。并积极参与神经元的活动，调节神经元的代谢和离子环境，对神经系统的发育和正常生理活动以及病理变化都具有重要作用。而且胶质细胞对正常脑发育、神经元的调控和中枢再生等方面所发挥的作用，已不亚于神经元本身。星形胶质细胞是中枢神经系统中最主要的胶质细胞，根据发生分化谱系的不同可分为1型(type 1 astrocyte, T1A)和2型(type 2 astrocyte, T2A)星形胶质细胞，两者行使着某些不同的生物学功能13。目前有关T1A和T2A基因表达差异的研究尚未见文献报道。本实验应用基因芯片技术研究T1A和T2A基因表达谱及其之间的差异，这对认识不同型别星形胶质细胞的功能有极其重要的意义。1 材料与方法1.1 细胞培养 取新生SD大鼠大脑皮质作原代混合胶质细胞培养，采用振荡法和胰酶差速消化法，结合使用富含血清培养基，分别纯化培养T1A和T2A4。将大鼠大脑T1A作为对照组，T2A作为实验组。1.2 基因芯片 采用上海博星基因芯片责任有限公司芯片，芯片类型为BiostarR-40S。1型星形胶质细胞（对照组）样品编号T1A，Cy3标记，2型星形胶质细胞（实验组）样品编号T2A，Cy5标记。1.3 细胞 总RNA提取 D-Hanks液洗涤纯化培养的T1A和T2A，每10cm2细胞加入2ml Trizol试剂裂解细胞，使之充分溶解,分别转移入 15 ml离心管，加入氯仿，1530放置3min，412000g/min离心15min,吸取上清分别至另一15ml离心管，加入异丙醇，1530放置10min，412000g/min离心10min,弃上清，加入75%乙醇，48000g/min离心10min，弃上清，超净工作台内干燥沉淀，加入适量DEPC水完全溶解RNA沉淀，-80保存。1.4 探针标记和杂交 （1）预杂交：预杂交液95水浴变性2 min，预杂交的玻片95水浴变性30 s取出放入无水乙醇中30s，晾干后将变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42预杂交56h；（2）标记探针：分别在2个 Eppendorf管中依次加入ddH2O 23l、逆转录引物5l和T1A或T2A总RNA 100g，反应总体积50l。混匀置70水浴10min，取出后迅速置冰，分别加入逆转录酶缓冲液10l、DTT 5l和dNTPs 4l，在暗室中加入逆转录酶2l和Cy3-dCTP（T1A管）或Cy5-dCTP（T2A管）3l，混匀样品，室温2min，42水浴2 h，加入标记试剂I 4l，65水浴10 min后加入标记试剂 II 4l，混匀，合并实验组和对照组，避光，真空抽干至50l，DNA纯化柱纯化DNA，加入标记试剂III 8l，真空抽干；（3）杂交：在抽干的探针管中加入6.5l杂交试剂I，充分混匀至探针溶解，再加入6.5l杂交试剂II，混匀备用。将预杂交的玻片取出并去除盖玻片，探针置95水浴变性2min取出后迅速置冰，玻片置95水浴变性30s取出浸入无水乙醇30s，将探针置于芯片上，盖玻片覆盖，置于杂交舱中并以Parafilm密封，42杂交箱内杂交18h，取出玻片并去除盖玻片，洗片剂洗涤后晾干扫描。1.5 杂交结果检测和图像分析 用ScanArray 4000扫描仪扫描芯片，通过芯片图像分析软件GenePix Pro3.0对芯片灰度扫描图进行分析。收集Cy3和Cy5荧光标记信号值（基因点Cy3信号和Cy5信号各自的前景信号值减去它的背景信号值），将Cy5信号值小于200的以200取代以避免弱信号对实验结果的干扰。为校正Cy5、Cy3标记体系间的系统误差，均对实验数据进行均一化处理：计算每个有效基因点（Cy3、Cy5信号值皆大于200，或其中之一大于800；Cy5 /Cy3在0.110之间）的Ri（=Cy5 /Cy3）的自然对数值r = ln (Cy5 /Cy3)，算出全部有效基因点r的平均值r， 实验的均一化系数ND就等于r的倒数即ND=EXP(r)。将所有基因点的Cy3信号值乘ND，得出调整后的Cy3*，将所有小于200的Cy3*值以200取代以避免弱信号对实验结果的干扰。计算每个基因点在本次实验中的表达差异值Ratio（Cy5/Cy3*），Ratio>2或<0.5的数据项表示差异表达的基因。2 结果2.1 总RNA提取 正常SD大鼠大脑1型和2型星形胶质细胞总RNA提取结果：T1A总RNA及T2A总RNA电泳结果均可见清晰的18S和28S条带，两者亮度比为12，隐约可见5S条带，表明RNA没有降解，纯度较高，符合实验要求（图1）。2.2 基因表达谱 基因芯片上测定了4096个点，包括1500条已知基因，2548条未报道基因，其中48个阴性对照点（8个水稻U2RNA基因点、8个HCV外壳蛋白基因点和32个空白点样液点），实验中这些点的杂交信号很低。经过2次重复试验，发现在T1A高表达(Ratio<0.5)的基因分别有157条和195条，而在T2A高表达(Ratio>2.0)的基因分别有195条和244条。最后筛选出两次试验中均出现高表达的基因，它们在与两种荧光标记的探针杂交时表现出较大的差异，且上下调趋势一致，程度相似，认为它们是表达存在差异的基因，分别有113条和154条基因在T1A（Ratio<0.5）和T2A（Ratio>2.0）中高表达。统计结果见表1，两型星形胶质细胞基因表达谱（图2、图3，见封三）。3 讨论基因芯片是将大量的靶基因片段有序地、高密度地固定在玻璃、硅等载体上，以检测不同样本基因表达情况的一项技术。自1995年Stanford大学的Schena M等发表第一篇应用基因芯片的论文以来，基因芯片已广泛用于基因功能的研究57。基因芯片技术大大推动了功能基因相关分子生物学的研究。基因表达谱芯片是目前应用最广泛的基因芯片，是将几千个基因特异探针或其cDNA片段固定在一块基因芯片上，对来源于不同个体（正常人与患者）、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同病变、不同刺激（包括不同诱导、不同治疗手段）下的细胞内的mRNA或逆转录产物cDNA进行检测，从而大规模对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断。与传统研究基因表达差异的方法相比8，9，基因表达谱芯片具有许多优点：检测系统微型化，对样品等需要量非常小；能同时研究成千上万条基因的表达变化，研究效率明显提高；能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系，从而研究基因与基因之间内在作用关系；能更全面地研究某一表型或病症的所有相关基因；检测基因表达的灵敏度高。T1A和T2A在发生时间、细胞形态及功能等方面均有不同之处：(1) T1A见于胚胎16天，表达Cx4310、参与诱导血脑屏障的形成、表达主要组织相容性复合物和参与神经免疫等；(2) T2A见于生后14天，可合成硫酸软骨素、聚积氨基丁酸、参与细胞外神经递质的调节，并围绕在郎飞氏结周围参与中枢神经系统髓鞘的形成11。本实验室的研究也发现，星形胶质细胞瘤的发生发展亦与星形胶质细胞谱系密切相关12。本研究应用基因芯片技术研究了两型星形胶质细胞的基因表达谱，在较大的基因谱范围分析了两者在基因表达水平的差异。经过2次重复，发现有267条基因的表达存在明显的差异，其中154条在T2A中高表达，113条在T1A中高表达。这些差异表达基因是用传统的研究方法所难以发现的，它们与星形胶质细胞发生与分化、生长、细胞周期、细胞凋亡、离子转运和细胞间信号传导等有关。我们将进一步对这些差异表达的基因进行鉴定和功能分析，探讨它们在两型星形胶质细胞各自生物学功能特性方面的作用，并为中枢神经系统损伤修复研究及神经胶质瘤等星形胶质细胞相关疾病防治研究提供实验依据。【参考文献】 1 Brown DR. 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