低氧条件培养的PASMCs凋亡与p53表达变化.doc

低氧条件培养的PASMCs凋亡与p53表达变化 作者：彭利静 李伟 段永宏 李志超 【Abstract】 AIM: To observe apoptosis and p53 expression changes in hypoxia cultured rat pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMCs). METHODS: The PASMCs were cultured primarily by tissueculture method. The number of apoptotic cells was measured by Hoechst staining and flow cytometry. P53 expression in PASMCs was demonstrated by immunofluorescence(IF) staining and observed by confocal microscopy. RESULTS: Hoechst staining and flow cytometry showed that the number of apoptotic cells was not significantly different between control group and hypoxic 24 h group. IF staining showed that the expression intensity of p53 was increased significantly in hypoxic 24 h group than in control group. CONCLUSION: In the cultured PASMCs, hypoxia does not enhance cell apoptosis, but increases p53 expression. 【Keywords】 anoxia; pulmonary artery; muscle, smooth/cytology; genes, p53; apoptosis 【摘要】 目的： 观察低氧条件下离体培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的凋亡和p53表达的变化. 方法： 采用组织块法原代培养大鼠PASMCs，应用Hoechst染色以及流式细胞术观察低氧对细胞凋亡的影响；采用免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察p53在低氧条件培养的PASMCs中的表达变化. 结果： 正常条件下培养的PASMCs 和低氧条件下培养的PASMCs的凋亡变化不大，荧光显微镜下凋亡细胞计数后亦未见有统计学差异. p53在培养的大鼠PASMCs中有少量表达，低氧刺激可使其表达增高（P<0.05）. 结论： 低氧未能诱导离体培养的PASMCs凋亡增加，但可以诱导p53在培养的大鼠PASMCs中的表达增加. 【关键词】 缺氧；肺动脉；肌，平滑/细胞学；基因，p53；细胞凋亡 0引言 肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension, PAH）是临床上常见的呼吸系统疾病，肺血管收缩和肺小血管结构重建是其发病的基本病理过程；目前研究认为，肺血管壁细胞增殖和凋亡的失衡是肺血管壁结构重建的重要原因1-2. p53是近年研究最为广泛和深入的肿瘤抑制基因之一，由于在慢性肺动脉高压的形成过程中，也有类似肿瘤细胞的过度增殖以及细胞凋亡的变化. 因此，研究p53在肺动脉高压发生中的作用，对于了解肺动脉高压的发病机制，指导临床治疗有一定的积极作用. 本研究我们采用组织块法原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs），应用Hoechst染色以及流式细胞术观察低氧对细胞凋亡的影响，同时采用免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜观察p53表达的变化，了解p53在肺小血管结构重建中的作用. 1材料和方法 1.1材料雌雄不拘SD大鼠，体质量150180 g（第四军医大学实验动物中心）；RPMI1640培养液（GIBCO公司）；新生牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所）；p53多克隆兔抗鼠IgG, FITC标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；细胞凋亡Hoechst染色试剂盒（Beyotime生物公司）；三气培养箱（德国Heraeus公司）；激光扫描共聚焦显微镜MRC1024（美国BIORAD公司）. 1.2方法 1.2.1大鼠PASMCs的分离及培养采用组织块法原代培养. 健康大鼠用200 g/L乌拉坦(4 mL/kg)腹腔麻醉后打开胸腔，无菌操作分离肺动脉，剥离血管外膜组织，纵向剪开血管，刀片轻刮内膜，置于盛有2 mL新鲜RPMI1640培养液（含有150 mL/L小牛血清）的青霉素小瓶中，剪成约1 mm1 mm1 mm大小组织块，均匀贴于25 mL培养瓶底部，补加3 mL培养液，盖好瓶盖并拧松半圈，将培养瓶底部向上放入CO2孵箱. 37， 50 mL/L CO2, 950 mL/L O2条件下孵育4 h后，反转培养瓶. 35 d后，即可在镜下观察到有细胞晕出现. 观察细胞生长状况，23 d换一次培养液，1013 d后可用2.5 g/L胰酶消化传代. 实验选用培养至第35代的细胞进行. 1.2.2实验分组分为正常对照组和低氧24 h组. 正常对照组置于37, 50 mL/L CO2, 95 mL/L O2孵箱内培养，低氧组置于37, 20 mL/L O2, 50 mL/L CO2, 930 mL/L N2孵箱内培养. 1.2.3培养大鼠PASMCs Hoechst染色将实验细胞制备成单细胞悬液，以5104/L密度、每孔2 mL分别接种入2个24孔板内，37，50 mL/L CO2, 950 mL/L O2孵箱培养. 24 h后换无血清培养液，分组培养24 h后吸尽培养液，按试剂盒说明书进行操作，染色5 min后在荧光显微镜下（200）观察. 随机采集5个不重复视野，计数每100个细胞中凋亡细胞数目. 1.2.4培养的PASMCs流式细胞术检测将细胞消化后以5104/L密度种入100 mL培养瓶内，37，50 mL/L CO2 , 950 mL/L O2孵箱培养. 24 h后各组均换成无血清培养液，分组继续培养24 h后终止，制成单细胞悬液，进行AnnexinVflous标记染色，测定细胞凋亡. 1.2.5培养的PASMCs的p53免疫荧光染色及观察取制备好的单细胞悬液，以5104/L密度、每孔2 mL分别种入2个24孔板内爬片，37， 50 ml/L CO2 950 mL/L O2孵箱培养. 24 h后换无血清培养液. 分组继续培养24 h后，常规固定、冲洗、封闭，滴加1100稀释的兔抗鼠p53 IgG，4湿盒过夜，次日滴加FITC标记山羊抗兔IgG，37，2 h后冲洗封片. 激光扫描共聚焦显微镜观察，激发光波长488 nm，放大倍数4001.23（40倍油镜）. Lasersharp图像分析软件，分析单个细胞核平均荧光强度. 统计学处理：所有实验数据均采用SPSS10.0统计学软件进行t检验分析处理，结果用xs表示. 2结果 2.1低氧对细胞凋亡的影响正常组织细胞经Hoechst染色后，荧光显微镜下可观察到蓝色的细胞核. 凋亡细胞由于核固缩、核碎裂、溶解，染色后可观察到细胞核致密浓染，或呈碎块状. 本实验显示正常条件下培养的PASMCs凋亡数与低氧24 h组的PASMCs的凋亡数没有明显差异(164) vs (173), n=5, P>0.05. 流式细胞术是应用双染色法标记检测细胞凋亡较敏感的方法. 结果同样显示： 正常对照组凋亡细胞数为4.5，低氧24 h组凋亡细胞数为5.6. 以上结果均提示低氧条件未能诱导离体培养的PASMCs凋亡增加. 2.2低氧对大鼠PASMCs中p53表达的影响免疫荧光染色后，可见正常对照组细胞核荧光较淡，部分细胞甚至未见有荧光发出. 低氧24 h组几乎所有胞核都有较强荧光发出，荧光强度与正常对照组相比明显增强(48.14.7) vs (15.72.2), n=5, P<0.05，表明p53表达明显增加 (图1). A： p53在常氧培养的PASMCs中的表达；B： p53在低氧24 h培养的PASMCs中的表达 图1培养的PASMCs的p53免疫荧光染色4001.23（略） 3讨论 PAH常引起严重的呼吸血流功能紊乱，治疗困难，一直是临床研究的重点. 其中，低氧所引起的慢性PAH的形态学特征主要表现为肺小动脉中层平滑肌细胞增生、增大. 细胞凋亡是调节细胞数量的重要方式. 故观察PASMCs的增殖和凋亡对探讨慢性PAH的发病机制、指导临床治疗研究更有意义. 文献3报道：在慢性PAH大鼠的肺小动脉壁细胞增殖的过程中，细胞凋亡显著增加，且凋亡细胞数随低氧时间延长而增加. 其生理意义在于试图从整体上维持平滑肌细胞数目的动态平衡. 本研究提示在用低氧刺激离体培养的PASMCs时，细胞凋亡无显著变化，说明离体状态下，低氧并不是诱导PASMCs的凋亡增加的直接因素. 因此推论，慢性PAH大鼠的肺小动脉壁细胞凋亡的明显增加是神经、体液等因素共同作用的结果，而非低氧的直接结果. p53是抑癌基因，也是凋亡相关基因，其表达增多和磷酸化可以诱导细胞中的DNA损毁，从而诱导细胞凋亡4. p53还能通过细胞凋亡相关分子的表达，增强细胞对凋亡刺激的敏感性. 相关实验证明，低氧能增加神经细胞、心肌细胞、肿瘤细胞等的凋亡以及凋亡相关因子p53, bax表达的显著变化5. PAH的发生发展及其严重程度与PASMCs的凋亡密切相关，诱导凋亡可以减轻肺动脉高压的发病程度6. 本实验结果表明低氧不能直接诱导的离体培养的PASMCs的凋亡增加，但可以诱导p53的表达显著增加，提示p53有可能参与了低氧诱导的慢性PAH大鼠的肺小血管壁平滑肌细胞凋亡的调控，从而参与了肺小血管壁结构的重建. 【参考文献】 1 Mandegar M, Cheng YB, Huang W, et al. Cellular and molecular mechanisms of pulmonary vascular: Role in the development of pulmonary hypertensionJ. Microvasc Res, 2004,(68)：75-103. 2 Humbert M, Morrell NW, Archer SL, et al. Cellular and molecular pathobiology of pulmonary arterial hypertensionJ. J Am Coll Cardiol, 2004,43(12)：13S-24S. 3 彭利静，李志超，李伟. 慢性低氧性肺动脉高压大鼠肺组织p53表达增高J. 基础医学与临床,2006,26（9）: 984-987. 4 张振锋. P53与人类肺癌研究进展J. 国外医学内科学分册,1999,26（6）:255-261. 5 Chattergoon NN, DSouza FM, Deng W, et al. Antiproliferative effects of calcitonin generelated peptide in aortic and pulmonary artery smooth muscle