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利用基因芯片技术检测BRAF基因在胰腺癌组织中的表达 作者：汤永辉，石欣，卫文俊，程张军，高乃荣 摘要目的:研究BRAF基因在正常胰腺与胰腺癌组织中表达的情况。方法: 收集正常胰腺组织3例以及胰腺癌手术切除标本6例，后者均经病理学检查证实；用TRizol法对组织进行总RNA抽提，采用无RNA酶的DNA酶等方法进行纯化；通过紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳以及Labonchip对总RNA进行质控；利用寡核苷酸芯片技术检测正常胰腺和胰腺癌组织中BRAF基因的表达，并且应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术加以验证。结果: 总RNA的OD260nm/OD280nm之值在1.82.0之间；琼脂糖凝胶电泳18s和28s电泳条带清晰，且28s和18s亮度之比2；Labonchip检测显示18s和28s双峰比例及位置均正常，无降解杂峰出现。芯片杂交扫描图像信号清晰，具有较低的整体背景和较高的信噪比；Ratio分析表明，BRAF基因在胰腺癌组织中表达上调（Cy3/Cy52.0）。 RTPCR验证了胰腺癌组织中BRAF mRNA表达上调。结论: BRAF基因在胰腺癌组织中表达上调，其在胰腺癌发生发展过程中的作用机制还有待于进一步探讨。 关键词胰腺癌；BRAF基因；寡核苷酸芯片；逆转录聚合酶链反应 BRAF基因别名鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(vraf murine sarcoma viral oncogene homolog B1)，Ikawa等1发现该基因能诱导禽原代细胞增殖和NIH3T3细胞的转化，确定其为一种癌基因，在许多肿瘤中存在BRAF基因的突变，并与细胞癌变密切相关1-3。该基因与各种肿瘤的关系已成为研究热点，但目前尚没有该基因在胰腺癌组织中表达水平的报道。本实验利用寡核苷酸芯片技术检测正常胰腺和胰腺癌组织中BRAF基因的表达情况，并用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase reaction, RTPCR)进行验证，现报道如下。 1 材料与方法 1.1 临床组织标本与病人签订知情同意书后，收集东南大学附属中大医院2004年612月胰腺癌手术切除标本6例，所有标本均经病理学检查证实，其中男性3例, 女性3例，年龄5671岁，平均65.2岁。临床分期采用1987年国际抗癌协会（UICC）的TNM分期：期1例，期1例，期2例，期2例。正常胰腺组织3例，取自外伤性胰腺损伤需切除部分胰腺者。手术切除后立即切成小块，置于-80保存。 1.2 试剂与仪器末端带氨基标记的寡核苷酸探针 （上海博亚公司）， UV755B型紫外分光光度计（上海精密科学仪器公司），Trizol （Sangon公司）， SuperScrip反转录酶 (Cat.No.18064014，Invitrogen公司），QIAGEN RNeasy Kit 、 QIAquick PCR purification Kit 、QIAquick Nucleotide Removal Kit （QIAGEN公司），RNA酶抑制剂 (Cat.No.D2311A)、DNase （Takara公司），限制性内切酶TspRI（New England Biolabs），Taq DNA 聚合酶 (Promega 公司), Cy3dCTP (Cat.No.PA53021)、Cy5dCTP (Cat.No.PA55021)（Amersham Phamacia Biotech 公司），Agilent2100分析仪、Agilent2100扫描仪（美国Agilent公司产品）等。 1.3 寡核苷酸芯片的制作基因表达谱寡核苷酸芯片由上海生物芯片公司提供，按照探针设计原则设计寡核苷酸探针，由上海博亚公司合成末端带氨基标记的寡核苷酸探针BRAF基因（基因代码），NM_004333（GenBank号），Hs162967（Unigene号），2 513（序列长度），5CGA GTG ATG ATT GGG AGA TTC CTG ATG GGC AGA TTA CAG TGG GAC AAA GAA TTG GAT CT3（探针序列）。采用同型双功能偶联剂（APSPDC）包被玻璃基片，用OmniGrid100点样仪进行点样，点样后置于42过夜，在55用 2SSC/0.2% SDS/0.1% BSA洗片2030 min，再用纯水洗1 min，1500 r・min-1离心5 min干片，室温放置30 min，干燥器中避光保存备用。 1.4 总RNA抽提和荧光探针的制备用TRizol法对组织进行总RNA抽提，加入无RNA 酶的DNA酶处理，以提高样品纯度，并按QIAGEN RNeasy Kit操作方法进一步纯化总RNA。利用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳、Labonchip对总RNA进行质控，精确判断RNA样品的完整性；而对于未能达到质控标准的样品，应进行重新抽提和纯化。50 g总RNA通过反转录标记获得30 pmol的荧光探针，即可满足芯片杂交的需要。 1.5 芯片杂交实验组（胰腺癌cDNA探针）采用Cy3荧光标记，对照组（正常胰腺组织cDNA探针）采用Cy5荧光标记。分别将Cy3和Cy5荧光标记的探针约30 pmol溶解于20l杂交液（5SSC/0.2% SDS），然后置于PCR仪中，在95条件下变性2 min后于70条件下预杂交20 min，再将两种荧光标记的探针混合后滴加于芯片上，置于42杂交箱中避光杂交1618 h。杂交结束后，分别用洗液（2SSC/0.1% SDS）、洗液（1SSC/0.1% SDS）、洗液 (0.5SSC)各洗涤10 min，去离子水室温洗涤2 min，1500 r・min-1离心5 min干片，最后扫描并避光干燥保存。 1.6 图像扫描与数据分析用Agilent扫描仪进行扫描，使用Imagene3.0软件对图像进行分析，经过自动和人工定位与排列确定杂交点的范围，过滤背景噪音，提取得到基因表达的荧光信号强度值，利用内参照基因对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正，即数据的标准化处理，计算两种荧光Cy3与Cy5的比值。基因表达差异判断标准：（1）Cy3/Cy5之值2或0.5，即基因的表达差异在两倍以上；（2）Cy3或Cy5信号值之一必须大于800。 1.7 RTPCR总RNA经过DNA酶处理后逆转录成cDNA (Roche 公司逆转录试剂盒)，并将其在-20保存。BRAF引物序列为上游引物：5GTG AGG GCT CCA GCT TGT ATC AC3（exon 13），下游引物：5AAA CCA GCC CGA TTC AAG GAG GG3（exon 18）。扩增产物与限制性内切酶TspRI在65条件下培育6h，野生型BRAF基因exon 15没有发生突变，不能被TspRI酶切，而突变型BRAF基因则被酶切产生621 bp大小的目标产物4。3 磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因被用作管家基因，以衡量加样的一致性。GAPDH的上游引物为5 CTC ATG ACC ACA GTC CAT GCC ATC 3，下游引物为 5CTG CTT CAC CAC CTT CTT GAT GTC 3，目标产物大小为585 bp。引物由Amplimmun AG公司合成。 1.8 统计学分析计量资料以x-s表示，采用MannWhitney U检验比较两组间差异。 2 结 果 2.1 正常胰腺和胰腺癌组织总RNA抽提及质量鉴定结果总RNA的OD260nm/OD280nm之值在1.82.0之间；琼脂糖凝胶电泳发现18s和28s电泳条带清晰，且28s和18s亮度之比2；进一步用Labonchip检测分析显示，18s和28s双峰比例及位置均正常，无降解杂峰出现（图1），以上结果均说明总RNA纯度高、无降解、质量好。 2.2 正常胰腺和胰腺癌组织芯片杂交结果正常胰腺组织和胰腺癌组织经芯片扫描后发现，BRAF基因的荧光强度比值（Cy3/Cy5）在6例胰腺癌标本中有5例（83.3）均大于2，平均Ratio值为3.2410.53，而正常胰腺组织平均比值为1.0110.03，与正常组织相比，BRAF基因在胰腺癌中表达明显上调(P<0.01)。 2.3 正常胰腺和胰腺癌组织BRAF mRNA表达水平本研究应用RTPCR技术检测BRAF mRNA的表达，正常胰腺组织的BRAF基因表达较弱，胰腺癌组织中BRAF 基因表达信号强。作为内参照基因，正常胰腺和胰腺癌组织中GAPDH基因的表达基本一致(图2)。M. PCR Marker（自上而下依次为1000、800、600、400、 200和100bp）；N. PCR阴性对照；+. 阳性对照；以上PCR扩增重复3遍，结果经过计算机扫描(ImagePro Plus, Version 3.0.01)，用标准曲线法进行半定量分析。正常胰腺组织BRAF mRNA为0.110.05，胰腺癌组织为1.010.41，上调9.18倍(P<0.01)。 3 讨 论本研究中我们主要应用寡核苷酸芯片技术，检测3例正常胰腺和6例胰腺癌组织中BRAF mRNA水平，发现与正常胰腺组织相比，胰腺癌组织中BRAF mRNA水平均上调,并且应用RTPCR技术进一步加以验证。BRAF基因是RAF家族的成员之一，该家族还包括ARAF和RAF1(CRAF)基因，其位于7q34，长约190 kb，编码含783个氨基酸的蛋白，为一种丝/苏氨酸特异性激酶(serine/threoninespecific kinases)，是RASRAFMEKERKMAPK信号通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。BRAF基因突变主要是exon15上的激活区发生由T到A突变（BRAF V600E），突变后导致BRAF蛋白激活，进一步活化MEK/ERK，进而影响肿瘤的进展。在胞浆,ERK(extracellular signal regulated kinase)发生磷酸化并激活p90RSKs，继而使凋亡诱导因子BRD失活或激活CREB（cAMP response elementbinding protein），影响细胞凋亡；在胞核中，激活的ERK能够影响多种与肿瘤相关的基因表达，如Cyclin D（细胞周期蛋白 D）表达增加、原凋亡蛋白Bim家族表达下降、血管内皮生长因子表达上调等等。目前，相关BRAF蛋白激活后对黑色素瘤细胞的生物学效应的研究已基本清楚，包括促进细胞增殖和侵袭、改变整合素的表达、降低E钙黏素表达以及增加基质金属蛋白酶（MMP）分泌5；采用RNA干扰(RNAi)技术使BRAF V600E突变沉默，能够有效降低MAPK活性，抑制细胞生长和促进凋亡6；体内和体外试验也均证实，人黑色素瘤细胞株对特异性MEK激酶抑制剂普遍敏感7。随着对BRAF基因的不断研究，其对胰腺癌等肿瘤的作用机制进一步明确，从而为胰腺癌等肿瘤的早期诊断和干预提供了可能，并为靶向治疗提供重要的理论基础3。 参考文献 1IKAWA S, FUKUI M, UEYAMA Y, et al. Braf, a new member of the raf family, is activated by DNA rearrangementJ. Mol Cell Biol, 1988, 8: 26512654. 2DAVIES H, BIGNELL G R, COX C, et al. Mutations of the BRAF gene in human cancerJ. Nature,2002，417: 949954. 3CALHOUN E S, JONES J B, ASHFAQ R, et al. BRAF and FBXW7 (CDC4, FBW7, AGO, SEL10) mutations in distinct subsets of pancreatic cancer: potential therapeutic targetsJ. Am J Pathol, 2003, 163: 12551260. 4RIMOLDI D, SALVI S, LIENARD D, et al. Lack of BRAF mutations in uveal melanomaJ. Cancer Res, 2003, 63: 57125715. 5SMALLEY K S. A pivotal role for ERK in malignant melanomaJ. Int J Cancer, 2003, 104: 527532. 6HINGORANI S R, JACOBETZ M A, ROBERTSON G P, et al. Suppression of BRAF(V599E) in human melanoma ab