口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达.doc

口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达作者：李杰, 王若, 石玮, 边海霞, 张丽, 张雷, 王家鑫【摘要】 目的: 构建口蹄疫病毒VP1基因的真核表达载体, 转染并筛选稳定表达VP1的树突状细胞(dendritic cell, DC)。方法: 将pMD18VP1克隆于pcDNA3.1(+)中, 构建重组质粒, 酶切鉴定, DNA测序证实序列正确后, 利用脂质体将重组质粒转染DC, 经含G418培养基筛选获得抗G418细胞克隆, 用Western blot鉴定FMDV VP1基因在DC中的表达。结果: 构建的pcDNA3.1VP1真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及序列分析证实了其序列的正确性, SDSPAGE和Western blot结果显示G418筛选获得DC稳定表达VP1。结论: 成功地构建了重组质粒pcDNA3.1 VP1真核表达载体, 并在DC中得到稳定表达。 【关键词】 口蹄疫病毒; VP1基因; 真核表达; 细胞转染; 树突状细胞Abstract AIM: To construct the eukaryotic expression vectors for the FMDV VP1 gene and transfect dendritic cells(DC) for the expression of VP1. METHODS: The plasmid pMD18VP1 was subcloned into pcDNA3.1(+) to construct recombinant eukaryotic expression plasmids named as pcDNA3.1VP1. The recombinant plasmids were transfected into DC by lipofectamine method and the positive cell clones were screened with G418. The expression of FMDV VP1 gene in DC was determined by Western blot. RESULTS: The correct construction of pcDNA3.1VP1 was identified by means of restriction enzyme analysis and nucleotide sequence determination. It was showed by SDSPAGE and Western blot that transfected cells, DC, expressed FMDV VP1 gene constantly. CONCLUSION: The pcDNA3.1VP1 eukaryotic expression plasmids are successfully constructed and VP1 gene can be sustainly expressed in DC.Keywordsfootandmouth disease virus; VP1 gene; eukaryotic expression; cell transfection; dendritic cell口蹄疫病毒(footandmouth disease virus, FMDV)分为O、 A、 C、 Asia I、 SAT1、 SAT2和SAT3等7个血清型。FMDV衣壳由4种结构蛋白VP1、 VP2、 VP3、 VP4各60分子组成, 其中VP1为主要的抗原蛋白, 在已发现的O型5个抗原位点中有3个位于VP1上。在VP1第140160位氨基酸处有一个长的、 结构稳定的GH环, 环上的氨基酸构成能刺激免疫应答的T、 B细胞抗原表位, 是病毒表面的主要抗原位点, 在其顶部形成一个高度保守的ArgGlyAsp(RGD)序列, 是FMDV与宿主细胞受体相结合的位点1, 2。VP1是口蹄疫病毒中惟一能够产生中和抗体的最重要的结构蛋白, 它以突起的形式暴露在病毒粒子的表面, 在免疫应答中发挥着主要作用3。因此, VP1成为各类新型疫苗研究的主要抗原之一。DC是目前已知的功能最强大的专职性抗原提呈细胞, 并能以交叉途径提呈非复制性抗原, 激活CD8+T细胞, 从而发挥对病原体的杀伤作用4。基因转染的DC可以激活CD8+T细胞产生IFN5, 并诱导CD4+T细胞产生更多的Th1型细胞因子, 因此, 基于DC的基因工程研究已成为抗病毒免疫的一个热点问题6。有报道显示, DC在机体抗FMDV感染免疫中发挥重要作用7, 但野毒感染可造成DC功能严重损伤。同时, 由于对FMDV的灭活处理可直接改变病毒蛋白的抗原性质, 所以用灭活FMDV作为抗原来源研究DC提呈抗原的机制则不能反映机体的自然过程。因此, 将FMDV的VP1基因转染DC, 使其表达VP1就成为研究DC提呈FMDV抗原机制的理想途径之一。本研究中, 我们构建了口蹄疫病毒VP1基因的真核表达质粒pcDNA3.1VP1, 利用脂质体转染DC, 得到了稳定表达。1 材料和方法1.1 材料 O型FMDV的pMD18VP1质粒由军事兽医学研究所金宁一教授惠赠, 大肠杆菌感受态细胞DH5和普通质粒小提试剂盒购自北京天根公司, 凝胶回收试剂盒、 T4连接酶、 EcoR I、 Hind III、 Sac I限制性内切酶购自大连宝生物公司, D7500和D2000为北京天根公司产品, LipofectamineTM 2000 Reagent为invitrogen公司产品。G418为Solarbio公司产品。仓鼠抗小鼠CD11c购于BioLegend公司, 异硫氰酸荧光素标记(FITC)羊抗仓鼠IgG和FITC标记羊抗小鼠IgG购于eBioscience公司, FITC标记羊抗兔IgG购Santa Cruz公司, 小鼠抗MHC Class1Ab购于Chemicon公司, 硝酸纤维膜(NC 0.45 m)购于Scientific Research Special公司。1.2 方法1.2.1 单核细胞源树突状细胞(MoDCs)的制备 无菌条件下, 用摘眼球法进行BALB/c小鼠采血, 放入含肝素钠的离心管中, 摇匀。加入等量的Hanks液, 混匀。然后轻轻至于淋巴细胞分离液上, 使二者之间有一清晰界面, 室温下, 以2 000 g离心20 min。用滴管吸出中间薄层细胞, 用Hanks液悬浮细胞, 室温下, 以1 500 g离心10 min, 洗涤2次。弃去上清液, 然后用RPMI 1640完全培养液将细胞悬液加入到培养瓶中, 置37、 50 mL/L CO2培养箱中孵育3 h后弃上清液, 用37预热RPMI 1640完全培养液轻轻洗涤贴壁细胞2次, 去除非贴壁细胞, 即得贴壁单核细胞。在培养瓶中加入含20 g/L rmGMCSF和20 g/L rmIL4的RPMI 1640完全培养液中培养, 每隔两天半量换液1次, 补充新鲜培养液, 连续3次。第7天, 弃去非贴壁细胞, 加入5 mL, 5 mol/L EDTA/PBS于培养皿中, 37孵育20 min, 反复用力吹吸培养瓶中的培养基, 使贴壁细胞完全脱落, 室温下1 500 g离心10 min, 吸去上清, 将沉淀重悬在适量的RPMI 1640完全培养液中, 用DMSO配成10%细胞悬液, 冻存于液氮中备用。1.2.2 MoDCs的鉴定 将MoDCs分别用小鼠抗MHC Class1-Ab和仓鼠抗小鼠CD11c以及兔抗牛S100多克隆抗体标记MoDCs, 再依次加入FITC标记羊抗鼠IgG, FITC标记羊抗仓鼠IgG和FITC标记羊抗兔IgG, 进行免疫荧光染色, 用流式细胞仪(FACS 420型)对其进行表型分析鉴定。1.2.3 pcDNA3.1VP1重组质粒的构建 将pMD18VP1重组质粒和转座载体pcDNA 3.1(+), 分别用EcoR I及Hind III进行酶切, 37 酶切5 h, 用TaKaRa凝胶纯化回收试剂盒的方法回收VP1基因片段及线性化pcDNA 3.1(+), 用T4 DNA连接酶16连接过夜, 构建重组转座质粒pcDNA3.1VP1, 转化大肠杆菌DH5, 挑取单菌落, 提取质粒经酶切鉴定, 并进行测序。1.2.4 G418浓度梯度实验 复苏MoDCs进行计数, 用无血清RPMI 1640培养液调整细胞密度为1106/L, 接种于24孔培养板中, 每孔加入100 L的细胞悬液及无双抗的培养基900 L。每孔中添加G418浓度为0、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900、 1 000、 1 100 mg/L 12个等级, 每3 d换1次液, 培养14 d记录细胞全部死亡的最低浓度。以最低浓度向上增加一个稀释度作为筛选浓度。1.2.5 质粒的线形化处理 pcDNA3.1VP1用Sac I酶切处理5 h, 在紫外灯下回收目的片段, 称重, 用凝胶回收试剂盒回收, 纯化(线性化的质粒利于细胞的转染)。1.2.6 转染MoDCs 复苏MoDCs后5 h进行计数, 用无血清培养液调整细胞密度为1.2109/L, 接种于6孔培养板中, 于37、 50 mL/L CO2的饱和度湿度下培养, 待细胞生长至70%80%覆盖率时进行转染。按照LipofectamineTM2000试剂盒操作说明书进行空质粒pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1VP1的转染MoDCs, 转染后48 h加入G418 (浓度为0.9 g/L)选择培养基加压筛选14 d后, 筛选得到阳性细胞克隆。扩增培养即为稳定表达口蹄疫VP1基因的MoDCs, 命名为DCVP1细胞。1.2.7 用重组质粒pcDNA3.1VP1免疫动物制备血清 选用3只健康的成年实验鼠, 第1次用普鲁卡因预处理后, 肌肉注射pcDNA3.1VP1质粒DNA, 每只100 g, 14 d后进行第2次肌肉注射, 每只注射100 g, 1月后, 进行第3次肌肉注射, 每只100 g, 1月后从实验鼠的眼静脉采血, 制备血清。1.2.8 阳性细胞克隆的Western blot检测 收集转染细胞, 用裂解缓冲液裂解后取20 g处理后的蛋白样品进行SDS PAGE, 取出凝胶至于硝酸纤维膜(0.45 m)上, 用BioRad公司的蛋白质转印系统在转移缓冲液中, 电泳转印(20 V, 30 min), 用50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h(封闭非特异性结合), 用上述免疫血清作为一抗(150), 室温2 h, 4过夜, 第2天取出NC膜, 室温孵育1 h, 用TBST洗膜310 min, 以羊抗小鼠lgGHRP(1300)作为二抗室温2 h, TBST洗310 min, DAB显色, 观察特异性条带。2 结果2.1 小鼠MoDCs的鉴定 从小鼠外周血中分离出的单核细胞在rmGMCSF和rmIL4诱导培养7 d后, 经流式细胞术分析, 99.79%以上的细胞表达MHCII分子, 99.75%以上的细胞表达CD11c, S100的表达率为99.23%, 表明本试验制备成了表型复合度很高的MoDCs(图1)。2.2 重组质粒pcDNA3.1VP1的构建 将pMD18VP1重组质粒和转座载体pcDNA 3.1(+), 分别用EcoR I及Hind III进行酶切后, 回收VP1基因片段及线性化pcDNA 3.1(+), 用T4 DNA连接酶连接, 构建成重组转座质粒pcDNA3.1VP1, 经EcoR I及Hind III酶切鉴定正确, 经琼脂糖电泳后, 在640 bp左右出现特异性条带(图2), 大小与预期的相符(639 bp), 测序结果显示VP1基因的读码框正确。2.3 抗G418细胞克隆的筛选 MoDCs在含有G418(终浓度为800 ng/L)的RPMI 1640培养液中生长10 d后全部死亡, 故900 ng/L的G418应为MoDCs合适的筛选浓度。转染细胞经筛选, 14 d后得到抗G418的阳性细胞克隆, 未转染的细胞则在G418培养液中逐渐死亡, 初步表明VP1基因转染MoDCs成功。2.4 Western blot检测FMDVVP1在MoDCs的表达 转染pcDNA3.1VP1重组质粒的MoDCs可检测出FMDVVP1的表达(图3), 而转染空载体pcDNA3.1和空白对照的MoDCs未检测到VP1的表达, 表明转染pcDNA3.1VP1成功。3 讨论口蹄疫是偶蹄动物的一种急性传染病, 自1879年Loeffer发现该病以来, 人们为控制该病做了不懈努力。FMDV结构蛋白VP1包含FMDV的主要抗原位点, VP1的141160及200213位氨基酸残基均是FMDV的抗原表位, 可刺激机体产生免疫应答8。因此, VP1基因在原核细胞或真核细胞中的表达一直是口蹄疫疫苗研究的热点。 本实验中, 我们将目的基因亚克隆到pcDNA3.1(+)表达载体, 对重组质粒进行双酶切电泳鉴定, 结果显示口蹄疫病毒VP1重组载体在640 bp和5 400 bp左右处均出现相应的目的条带, 表明目的基因已成功导入pcDNA3.1(+)表达载体。进一步测序证实, 本实验中口蹄疫病毒VP1基因的序列(639 bp)是完全正确的, 证明本研究已正确构建了pcDNA3.1VP1真核表达载体。通过Western blot鉴定外源性VP1基因在转基因MoDCs中的表达发现, 具有G418抗性的转染重组质粒pcDNA3.1VP1的MoDCs有目的蛋白VP1的表达, 说明DC能表达FMDV的VP1蛋白。总之, 本实验成功构建了口蹄疫病毒VP1基因的真核表达系统, 并在小鼠MoDCs中得到了高丰度表达, 为进一步研究FMDV的抗原提呈和新型疫苗研制奠定了良好的基础。【参考文献】 1 Marvin J. 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