基质金属蛋白酶9在哮喘大鼠中性粒细胞中的表达.doc

基质金属蛋白酶9在哮喘大鼠中性粒细胞中的表达作者：金微瑛，叶辉，童夏生，王恩智，郭海渊，阮正英 金小红【摘要】 目的:观察基质金属蛋白酶9(MMP-9)在哮喘大鼠血中性粒细胞(PMN)中的表达，探讨PMN能否通过合成MMP-9参与哮喘的发病。方法：健康雄性SD大鼠30只，随机分成哮喘组（A组）、布地奈德治疗组（B组）和正常对照组（C组），用卵蛋白（OVA）致敏和激发的方法建立哮喘模型。分离纯化血PMN，免疫细胞化学法检测MMP-9的表达水平，ELISA法检测血清基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的浓度。结果：A组（0.1960.011，OD值）PMN MMP-9的表达水平显著高于C组（0.1000.010，OD值）（P <0.01），B组（0.1350.008，OD值）PMN MMP-9的表达水平显著低于A组但高于C组（均P <0.01）。A组血清TIMP-1为(34.964.54 )ng/mL，表达水平显著高于C组的(26.143.43) ng/mL（P <0.01），B组血清TIMP-1的表达水平显著低于A组但高于C组（P <0.05或P <0.01）。MMP-9与TIMP-1的表达水平呈显著正相关(n =29，r=0.713，P <0.01)。结论：哮喘大鼠PMN合成MMP-9的功能增加，PMN可能部分通过增加合成MMP-9参与哮喘的发病，这种功能可以部分被布地奈德所抑制。 【关键词】 哮喘；MMP-9；TIMP-1；PMN；大鼠 Abstract: Objective: To observe the expressions of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in blood polymorphonuclear leukocyte (PMN) of asthmatic rats. And to approach whether PMN could participate in asthma pathogenesis through synthesizing MMP-9. Methods ：Thirty rats were randomly divided into three groups on average， including asthmatic group (group A)， budesonide treated group (group B) and control group (group C). Blood PMN were isolated and purified. The expressions of MMP-9 were detected with immunocytochemical method in blood PMN. The concentration of matrix metallo-proteinase inhibitor-1 (TIMP-1) was detected with ELISA. Results ：The level of MMP-9 in group A （0.1960.011，Optical density） were significantly higher than those in group C （0.1000.010）(P <0.01). Levels of MMP-9 in group B （0.1350.008） were significantly lower than those in group A， but higher than those in group C (all P <0.01). Levels of TIMP-1 in group A （34.964.54 ng/mL） were significantly higher than those in group C（26.143.43 ng/mL）(P <0.01). Levels of TIMP-1 in group B （29.582.41 ng/mL） were significantly lower than those in group A， but higher than those in group C （P <0.05 or P <0.01）. There was significant positive correlation between the level of MMP-9 and TIMP-1(n =29，r =0.713，P <0.01). Conclusion：Levels of MMP-9 synthesized by PMN increase in asthma rats. PMN may be implicated with asthma pathogenesis via increasing synthesis of MMP-9，but this function of PMN can be partly inhibited by budesonide. Key words: asthma；matrix metalloproteinase-9；TIMP-1；polymorphonuclear leukocyte；rat 支气管哮喘是一种由多种炎性细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症，气道重构和气道高反应性是其特征性病理改变。基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)及其抑制剂基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1），在哮喘的气道炎症和气道重构中起着重要作用1。最近研究发现，中性粒细胞（PMN）能释放多种酶、炎症递质和细胞因子参与哮喘的炎症过程2，但PMN能否通过MMPs/TIMPs体系参与哮喘的发病，目前知之甚少。本实验通过检测哮喘大鼠血PMN MMP-9和血清TIMP-1的表达水平，探讨它们在哮喘中的可能作用机制。 1 材料和方法 1.1 试剂 卵白蛋白（OVA）级和Histopaque分离液（Histopaque 1119和Histopaque 1083）购自美国sigma公司；山羊抗大鼠MMP-9一抗试剂盒购自美国Santa Cruz公司，兔抗羊二抗试剂盒和TIMP-1 ELISA试剂盒购自上海晶美公司。布地奈德由阿斯利康公司生产。 1.2 实验动物及分组 SPF级健康雄性SD大鼠30只，平均体重（23419）g，由温州医学院实验动物中心提供动物批号：SCXK（浙）2005-0019，SPF级环境中饲养。随机分成3组，每组10只，分为哮喘组（A组）、布地奈德治疗组（B组）和正常对照组（C组）。 1.3 动物模型的复制3 方法为：第1天和第8天腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液1 mL含OVA 1 mg和Al(OH)3 100 mg致敏，各1次。第15天开始每天向大鼠喷雾1% OVA 30 min，连续激发7 d。大鼠表现为烦躁不安、瘙痒、喘鸣、腹肌抽搐等症状。C组致敏和激发均以生理盐水替代OVA和Al(OH)3。B组处理基本同A组，不同的是在抗原首次激发前24 h和每次激发前1 h给予雾化吸入布地奈德2 mg/组。 1.4 血PMN的分离纯化4 末次激发24 h后，1%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉，心脏抽血4 mL，抗凝后加至备有Percoll分离液（Histopaque 1119和Histopaque 1083各4 mL）的离心管中，离心（700 r/min，4 ）30 min，取PMN富集层，低渗法溶解红细胞，台盼蓝染色查细胞活力>86%，瑞氏染色显示PMN纯度>89%。另抽血1 mL静置后取血清，ELISA法检测TIMP-1蛋白的浓度。 1.5 肺组织和支气管肺泡灌洗液（BALF）的制备 灌洗前先结扎左肺门，取左肺组织，经常规固定、石蜡包埋、切片，HE染色400倍光镜下观察肺组织的病理改变和炎性细胞浸润情况，免疫组织化学法测定MMP-9的表达。BALF的留取操作如下：气管插管，支气管肺泡灌洗3次（每次5 mL生理盐水），回收BALF，离心(4 ，3 000 r/min)10 min，沉渣经PBS重悬后行细胞总数计数和分类计数。 1.6 免疫细胞化学法 采用SP法，操作按说明书进行。主要包括抗原修复，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，兔血清封闭液，滴加一抗、二抗及链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物，DAB显色、复染、封固，PBS代替一抗进行阴性对照。每张细胞涂片随机计数50个阳性细胞，Image-pro Plus 5.1免疫组化图像分析系统对阳性细胞进行灰度扫描，取其平均值代表该片的光密度（OD）值。 1.7 统计学处理方法 采用单因素方差分析法的LSD法分析。两变量的相关分析采用直性相关分析法分析。 2 结果 2.1 肺组织病理改变 大鼠肺组织切片HE染色显示：C组细支气管形态规则、偶见炎性细胞浸润，管腔内见较少分泌物，上皮完整，肺泡形态规则；A组可见细支气管形态不规则，见较多的炎性细胞浸润，管壁增厚，黏液栓形成，杯状细胞增生，部分支气管上皮细胞排列不完整、可见炎性细胞嗜上皮现象。B组细支气管的炎症改变较A组显著减轻。 2.2 BALF中白细胞计数 A组BALF中细胞总数及淋巴细胞（LYM）、PMN和嗜酸细胞（EOS）的百分比均显著高于C组（均P <0.01），巨噬细胞（M）的百分比显著低于C组（P <0.01）。与C组相比，B组BALF中细胞总数及EOS、PMN的百分比均显著升高（P <0.01或P <0.05），M的百分比显著降低（P <0.05），LYM的百分比差异无显著性（P >0.05）。与A组相比，B组BALF中细胞总数及EOS、LYM的百分比均显著降低（P <0.01或P <0.05），M的百分比显著升高（P <0.01），PMN的百分比差异无显著性（P >0.05）(见表1)。 2.3 PMN中MMP-9的表达 阳性细胞的胞浆呈棕黄色表达，3组中PMN均有不同程度的表达。A组中PMN中MMP-9的表达水平显著高于C组（P <0.01），B组PMN中MMP-9的表达水平显著低于A组且高于C组（均P <0.01）（见表2、图1）。 2.4 血清TIMP-1的表达 A组血清TIMP-1的表达水平显著高于C组（P <0.01），B组血清TIMP-1的表达水平显著低于A组且高于C组（P <0.05或P <0.01）（见表2）。 2.5 MMP-9与TIMP-1的相关性 MMP-9与TIMP-1的表达水平呈显著正相关(n=29，r=0.713 P <0.01)。 3 讨论 哮喘是一种儿童时期常见的气道慢性疾病，涉及多种炎性细胞和炎性递质。一直以来，哮喘被认为主要是以EOS浸润为主的气道慢性炎症，但最近研究发现PMN同样具有不可忽视的作用。无论在哮喘急性发作期和致命性哮喘中，还是在轻度、中度和重度哮喘中，PMN在气道黏膜中表达均增加。本科先前的研究表明，哮喘时PMN处于激活状态，其分泌和黏附功能增加4。但PMN能否通过MMP-9参与哮喘的炎症过程，在国内尚未见报道。本研究通过复制大鼠哮喘模型，检测MMP-9在PMN上的表达水平及布地奈德对其表达的影响，以及它与血TIMP-1表达的相关性进行研究，探讨PMN参与哮喘炎症的可能作用机制。本研究发现，哮喘组BALF中细胞总数以及EOS、PMN、LYM占细胞总数的百分比均显著高于正常对照组，且光镜下也发现哮喘组肺组织炎症较正常对照组显著加重，表明大鼠哮喘模型得到成功复制。 哮喘是一种炎症性疾病，伴随着细胞外基质的降解和胶原的沉积。通过胶原的沉积，引起气道壁增厚，引起细胞外基质的重构。MMPs/TIMPs平衡是气道修复和重构的主要标志，与哮喘的气道炎症、气道重构和气道阻塞密切相关。MMPs主要由结缔组织、粒细胞、单核-巨噬系统分泌，其作用是参与哮喘气道重构，促使气道壁纤维化、平滑肌增生、气道高反应性等。TIMPs分为TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-47，可以抑制所有MMPs的活性形式，TIMP-1是所有TIMPs亚类中活性最强并能特异性抑制MMP-9的活性5。本实验结果发现，三组PMN中均有MMP-9呈阳性表达的细胞，证实了PMN 能分泌MMP-9。而哮喘组显著性高于正常对照组，提示哮喘组PMN合成MMP-9的功能增加。经布地奈德治疗后，其表达水平显著性下降，表明布地奈德可部分抑制PMN合成MMP-9。同时发现，哮喘组血清TIMP-1的浓度显著性高于正常对照组，布地奈德治疗后其表达水平显著性下降，提示哮喘时TIMP-1的表达也增加，其表达水平能被布地奈德抑制。MMP-9与TIMP-1呈显著正相关，提示两者在哮喘时均升高，共同参与哮喘的发病过程。Hauk等6发现，哮喘患者的BALF中MMP-9和TIMP-1蛋白的表达均升高，因此认为在气道重构的早期就出现上述炎症因子的改变。在有喘鸣发作的学龄前儿童BALF中，MMP-9和TIMP-1的表达也升高，且MMP-9/TIMP-1的升高程度与喘鸣持续发作有关7。经孟鲁司特治疗8周后，哮喘患者血清MMP-9的水平可显著性下降，而TIMP-1的水平则没有显著性改变8。 以上结果显示，PMN能合成MMP-9，且在哮喘大鼠中其合成功能增加，PMN可能部分通过MMP-9参与哮喘的发病，布地奈德减轻哮喘的炎症可能部分通过抑制PMN的合成功能起作用。 致谢:感谢温州医学院呼吸科李昌崇教授、动物实验中心的李安乐和赵惠玲老师及中心实验室陈小芳老师对本课题的指导和热心帮助。【参考文献】 1 王丽新, 石克华,吴银根.哮喘大鼠气道重塑模型与基质金属蛋白酶J.中国现代临床医学,2005,4(7):1-4.2 童夏生,李昌崇.中性粒细胞分泌功能与支气管哮喘J.国际呼吸杂志,2006,26 (1): 45-48.3 童夏生,李昌崇,李绍波. 中性粒细胞及其CD11b 在大鼠哮喘中的表达及地塞米松调控J. 温州医学院学报,2005,35(3):207-210.4 李昌崇, 童夏生, 阮正英,等.中性粒细胞弹性蛋白酶和IL-8 在大鼠哮喘中的作用及地塞米松调控J. 中华微生物学和免疫学杂志, 2005,25(9): 737-741.5 Matsumoto H,Niimi A,Takemura M,et a1.Relation ship ofairway