热休克蛋白60及其抗体在扩张型心肌病患者中的表达.doc

热休克蛋白60及其抗体在扩张型心肌病患者中的表达 作者：江儒文，刘唐威 ，伍伟锋【摘要】 目的 探讨扩张型心肌病（DCM）心肌组织中HSP60以及血清中抗人HSP60抗体在 DCM 发生、发展中的作用。方法应用免疫组织化学方法检测15例DCM患者及7例正常对照者心肌组织中HSP60的表达和分布；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测44例DCM患者和42例对照者血清中的抗人HSP60抗体水平。结果 DCM患者心肌组织中HSP60的表达明显增加，HSP60几乎全部为胞浆性表达，未见核阳性颗粒。DCM患者血清中的抗人HSP60抗体水平较对照组明显升高(P<0.05)。结论 DCM患者HSP60在心肌组织的过高表达及其血清抗体水平的升高，可能促进DCM的发生、发展，同时又为心肌提供一定的保护作用。 【关键词】 扩张型心肌病；热休克蛋白60；热休克蛋白60抗体 ABSTRACT:Objective To explore the roles of heat shock protein 60(HSP60) in myocardial tissue and serum antihuman HSP60 antibody in the initiation and progression of dilated cardiomyopathy (DCM).Methods The levels of HSP60 in myocardial tissue in 15 DCM patients and 7 controls were detected by immunohistochemical staining.The serum antiHsp60 antibody levels in 44 DCM cases and 42 controls were measured by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA).Results The expression of HSP60 increased significantly in the DCM hearts compared to the control hearts (P<0.05).Most of the HSP60 were observed in cytosol other than in nucleus or membrane.In comparison with the control group,there was an obvious increase in the serum antiHsp60 antibody levels of the DCM group(P<0.05).Conclusion The overexpression of HSP60 in DCM myocardial tissue might contribute to the initiation and progression of DCM,and meanwhile afford some protective effects on myoeardial response to stress.Maybe the elevated serum antiHSP60 antibody level has the similar effect. KEY WORDS：Dilated cardiomyopathy；Heat shock protein 60；AntiHSP60 antibody 热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)广泛存在于原核及真核细胞中，与细胞耐受和应激损伤关系密切。当细胞处于应激状态时，HSPs表达量明显提高1。HSP60是该家族中的重要成员。人HSP60主要存在于细胞线粒体中，其过表达和异位表达与自身免疫性疾病、特殊感染性疾病等关系较为密切2。HSP60可能参与一些心血管疾病的发生和发展，但心肌细胞中的HSP60又有重要的心脏保护作用，它可减轻各种有害因素对心肌的损伤3。近年来的研究提示，免疫病理改变是扩张型心肌病（DCM） 的重要环节，在DCM患者体内可以发现直接针对心肌抗原的抗体，心肌抗原包括肾上腺素能受体、肾上腺素能受体、肌球蛋白、HSP60等，HSP60及其抗体可能对DCM的发生和发展有着重要影响4,5。但有关HSP60及其抗体在DCM疾病过程中作用的研究报道比较少。本研究采用免疫组织化学法测定DCM患者心肌组织中HSP60的表达和分布，用ELISA方法检测DCM患者血清中抗人HSP60抗体滴度，以探讨HSP60以及抗人HSP60抗体在DCM中的作用。 1 资料与方法 1.1 一般资料 心肌组织标本的收集对象：DCM组15例，男10例，女5例，年龄4010岁，心功能按NYHA分级标准，级2例，级3例，级5例，级5例；正常对照组7例，男4例，女3例，年龄428岁。收集2005年3月至2006年3月在广西医科大学第一附属医院心内科就诊的44例DCM患者的血液标本和对照组42例的血液标本。对照组为缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy，IHD)、高血压性心脏病、冠心病患者。DCM组，男32例，女12例，年龄1765岁，平均39.2岁，心功能按NYHA分级标准，级8例，级14例，级17例，级5例；对照组，男27例，女15例，年龄2169岁，平均37.7岁，心功能按NYHA分级标准，级10例，级13例，级15例，级4例。上述所有DCM 患者均参照1995年世界卫生组织及国际心脏病学会联合会(WHO/ISFC)工作组关于心肌病的定义和分类的报告6进行诊断。以上标本的取得均得到患者或相关人员的同意。 1.2 心肌组织中HSP60的检测 标本收集和处理：10例DCM患者行右室心肌活检（EMB），在右室间隔靠心尖部钳取心肌组织。另外5例尸检的DCM和7例尸检的正常对照者，于死后6内尸检并在右室间隔近心尖部取心肌组织。心肌组织用10%中性福尔马林固定、石蜡包埋。每个蜡块切片作HE染色。每个蜡块切片作免疫组织化学染色，严格按照试剂盒说明书进行。鼠抗人HSP60 单克隆抗体购自美国Lab Vision公司，SupervisionTM鼠HRP免疫组化检测系统购自上海长岛生物技术有限公司，并用HPLAS1000型高清晰彩色病理图像免疫组化测量系统对每个切片进行分析，测量心肌组织HSP60阳性染色细胞的平均吸光度值。 1.3 血清标本中抗人HSP60抗体的检测 标本采集：选取采血对象时，应排除发热以及其他导致身体处于应激状态的疾病，同时避免使用免疫抑制剂和他汀类等药物，以免影响外周血中HSP60的抗体滴度7。非住院采血对象均于早晨空腹采血，所有住院患者均于入院次日清晨空腹卧位采血。取肘静脉血3.0ml 于干燥试管内，不抗凝，室温下放置1h，以1000g离心10min，取上层血清，放入70低温冰箱保存待测。采用ELISA法检测每一血清样本中的抗人HSP60抗体浓度，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。抗人HSP60抗体ELISA试剂盒购自加拿大Stressgen公司。 2 结 果 2.1 心肌组织HE染色光镜观察 与正常对照组的心肌组织比较，DCM组心肌细胞肥大，部分有变性，心肌细胞排列紊乱，心肌间质纤维明显增多（图1、2）。 DCM组心肌组织HSP60表达明显高于对照组(图3、4)。心肌组织阳性染色细胞的吸光度值DCM组为0.34 0.07，对照组为0.25 0.05，两组比较，差异有显著性（P<0.05）。 2.2 血清中抗人HSP60抗体的检测结果 血清中抗人HSP60抗体水平DCM组为11695.8 2676.0，对照组为8946.2 2976.6，两组比较，差异有显著性（P<0.05）。 图1 正常心肌组织（HE，400） 图2 DCM心肌组织病理学改变(HE，400)图3 正常心肌组织免疫组化染色（SP，400）图4 DCM心肌组织免疫组化染色（SP，400） 3 讨 论 HSP60正常情况下主要表达于细胞线粒体内，胞浆性HSP60可能也是人HSP60的重要表达位置，与线粒体HSP60一样，具有重要生理作用，并且在必要时可以自由进出于线粒体8。外周循环中也有HSP60及其抗体存在。Xu Q等9检测826名志愿者的血清HSP60时，发现约有33%的研究对象不能检测出HSP60，其余HSP60血清水平在（11000）ng/ml以内波动，其中有5%的HSP60血清水平>1000ng/ml。当循环中HSP60浓度达1000ng/ml时，就能激活巨噬细胞和血管内皮细胞而引起生物学效应 10。Pockley AG研究发现11，外周血HSP60水平还与性别有关，女性约为男性的3.5倍，而HSP60抗体水平则与性别无关，而且人HSP60抗体和微生物HSP60抗体均可测出。 本研究显示，HSP60在DCM心肌组织中表达较对照组明显增强。HSP60的异常表达几乎均为胞浆性表达，少量为胞膜性表达，未见胞核阳性颗粒。胞浆内的HSP60则可能与不利因子或成分结合防止其进入线粒体等细胞器12。Latif N等13观察到HSP60阳性细胞主要出现在心肌肌纤维的连接区域，认为可能是由于心肌细胞受损后HSP60释放到组织间隙中的缘故。Knowlton AA 等14分析心肌细胞中HSP60的表达，结果提示HSP60可能在DCM的发生及发展过程中起着心脏保护作用。本研究对照组中，也有HSP60阳性表达，与DCM组表现出一定的重叠性。这是由于HSP60作为分子伴侣，在许多应激或病理条件下表达增加，如慢性房颤病人心肌内也有HSP60表达增加15，只不过在不同情况下表现不同，有的不如在DCM中那么明显。但是，HSP60异位分布也可以产生不利因素，如导致抗体产生，而这些抗体则会引起组织损伤16。 本研究检测到DCM病人血清抗人HSP60抗体水平比对照组明显升高。这说明了血清中抗人HSP60抗体与DCM的发病或发展有关。Pockley AG等17研究认为外周HSP60及抗体与心血管疾病的早期发病有关系。Latif N等18应用WB法检测DCM和IHD患者血清抗 HSP60抗体，结果发现DCM和IHD的抗 HSP60抗体阳性率分别为85和42(P<0.01)，说明了有关HSP60的免疫反应是DCM免疫功能变化的一个重要表现。Portig I等5研究也发现DCM患者血清抗人HSP60抗体阳性率比CAD患者和健康者明显升高。 我们在方法上有所改进，对抗人HSP60抗体浓度有不同的记录方式。传统的检测要么是定性检测，要么是半定量检测抗人HSP60抗体。而本研究是采用确定浓度的标准品来制作标准曲线，所得到的待测标本结果都是绝对值，记录单位为ng/ml。这样可使不同实验中所得的结果可以进行比较。 DCM是一种不可逆性的原因不明的心肌疾病，其发病机制也不太明确。目前大多数学者认为DCM主要是慢性心肌炎的结局，主要病理机制有自身免疫介导、持续病毒感染、细胞凋亡、基因突变等，而HSP60及其抗体可能正是通过这些机制参与DCM的发生和发展。 结合本研究和文献资料分析，DCM患者心肌中HSP60的表达增加及血清抗人HSP60抗体水平升高可能参与DCM的早期发病和病情发展，两者均有产生免疫损伤等不利作用和相当程度的心血管保护作用，并具有一定特异性，还与疾病的严重程度有关。但本研究中由于取材等原因的限制，心肌标本和血清标本不能取材于同一研究对象，若有更多的DCM心肌标本和对照病例，并能解决取材来源不同的问题，则更有说服力。另外，HSP60是如何影响DCM的发生和发展，HSP60及其抗体能否作为DCM的诊断或早期诊断的参考指标，HSP60能否为DCM的防治寻找新的方法提供参考，这些问题有待于进一步研究。我们相信，如能尽早解决上述问题将有利于更好地阐明DCM的发病机制，并指导临床诊断和治疗，DCM难以诊治的局面将会得到极大地改观。【参考文献】 1Gething MJ,Sambrook J.Protein folding in the cellJ.Nature,1992,355(6355):332Chen W,Syldath U,Bellmann.Human 60Kda heat shock protein:a danger signal to the innate immunnesystemJ.J Immunal,1999,162(6):32123Chen HS,Shan YX,Yang TL,et al.Insulin deficiency downregulated heat shock protein 60 and IGF1 receptor signaling in diabetic myocardiumJ. 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