癌症高表达蛋白在原发性胆囊癌中的表达及其临床意义.doc

癌症高表达蛋白在原发性胆囊癌中的表达及其临床意义【摘要】 目的: 探讨原发性胆囊癌(PGC)组织中癌症高表达蛋白(Hec 1)的表达与浸润、 转移及预后的关系。方法: 首先, 随机选取PGC患者108例, 以慢性胆囊炎患者15例为对照, 应用SABC免疫组化方法检测Hec 1蛋白的表达。其次, 对108例PGC患者中的96例进行术后5年的随访, 分析Hec 1与PGC患者预后的关联。结果: Hec 1蛋白的表达与PGC组织的临床病理学特征及患者的预后均有密切的关系。在发生淋巴道转移及低分化的肿瘤组织中, Hec 1蛋白高表达。随着Nevin分级的加重, Hec 1蛋白的阳性表达率明显增加 (P<0.05)。此外, Hec 1蛋白阳性表达的PGC患者的5年生存率明显低于阴性表达的患者 (P<0.01)。结论: Hec 1蛋白可能与PGC的发生、 浸润、 转移有关; 联合应用Hec 1蛋白阳性表达率与其临床病理学分级, 有助于正确判断患者的预后。 【关键词】 Hec 1; 原发性胆囊癌; 临床病理学; 预后 近年来, 随着分子生物学技术的迅速发展, 大量研究已证实恶性肿瘤的发生是由于癌基因、 生长基因及其受体基因的活化, 以及抑癌基因的失活或丢失引起的, 研究原发性胆囊癌（primary gallbladder carcinoma, PGC）相关基因及其蛋白分子不仅对于理解其发病机制十分重要, 而且对于发现在诊断和评价预后中有临床意义的分子标记物也同样重要。 癌症高表达蛋白（highly expressed in cancer, Hec 1）是利用Rb蛋白C端通过酵母双杂交筛选人B 淋巴细胞cDNA文库时发现的, 其在肿瘤细胞系中的表达比正常组织和未转化细胞中丰富1。Hec 1蛋白属于细胞周期蛋白, 在终末分化的细胞中不表达, 在所有分裂旺盛的细胞中表达量高2。关于Hec 1蛋白的表达与PGC浸润、 转移的关系还不清楚。基于以上原因, 我们采用免疫组化方法检测108例PGC癌组织中Hec 1蛋白的表达情况, 探讨其与PGC发生、 浸润、 转移及预后的关系。 1 材料和方法 1.1 材料 20002002年胆囊癌手术标本108（男61, 女47）例; 年龄50.113.7 ( 3275)岁。患者术前均未行化放疗。随访时间560月。对照组标本15 例, 为慢性胆囊炎组织。所有标本均经病理证实。鼠抗人Hec 1单克隆抗体(mAb)（工作浓度150）和SABC免疫组化试剂盒均为Santa Cruz公司生产, 购自北京中山生物技术有限公司。 1.2 方法 采用免疫组织化学SABC法, 标本经40 g/L中性多聚甲醛固定, 石蜡包埋, 4 m连续切片, 70烤片15 min。切片脱蜡、 水化。30 mL/L H2O2灭活内源酶, PBS 漂洗5 min3次。正常羊血清室温孵育15 min。滴加2030 L PBS 稀释的一抗(150的Hec1 mAb) 4过夜。PBS漂洗5 min 3 次。二抗、 三抗依次37孵育45 min, PBS 漂洗5 min3次。DAB显色510 min, 自来水充分洗涤, 苏木素复染5 min, 脱水、 透明、 封片, 镜检。设阳性对照, 用PBS替代第一抗体作阴性对照。Hec 1蛋白表达阳性为胞核出现棕黄色颗粒。在400光镜下观察10个视野, 每个视野计数100个细胞, 阳性细胞计数打分标准如下: <5%细胞Hec 1阳性表达记为阴性(0分), 5%25%细胞Hec 1阳性表达记为1分, 26%50%细胞Hec 1阳性表达记为2分, 51%75%细胞Hec 1阳性表达记为3分, >75%细胞Hec 1阳性表达记为4分。 1.3 统计学分析 所有数据用SPSS13.0处理, 计数资料采用2检验。生存分析用KaplanMeier法。P<0.05表示差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 Hec 1蛋白表达与PG-C临床病理特征的关系 免疫组织化学染色结果显示, Hec 1蛋白在PGC组织中的阳性表达率为78.70%（85/108）, 而在慢性胆囊炎组织中的阳性表达率仅为6.67%（1/15）, 差异具有统计学意义(P<0.05)。经统计学分析可知, Hec 1蛋白的表达与PGC组织的临床病理学特征有密切的关系(表1)。Hec 1蛋白在发生淋巴道转移及低分化的肿瘤组织中, 阳性表达率高于无淋巴道转移及高中分化的肿瘤组织（P<0.05）, 强阳性表达率也随之升高。此外, Nevin IIII级的PGC组织中Hec 1蛋白的阳性表达率明显高于Nevin IVV级的PGC组织 (P<0.05)。表1 Hec 1蛋白表达与PGC临床病理特征的关系 2.2 Hec 1蛋白表达与PGC患者生存率的关系 Hec 1蛋白表达情况与PGC患者5 a生存率的关系分析见表2、 图1。根据Nevin分级和有无淋巴道转移分组的PGC患者中, 有Hec 1蛋白阳性表达的患者, 其5 a生存率则明显低于阴性表达者（P<0.05）。从生存分析结果看, 当Hec 1蛋白阴性表达时, PGC患者的生存率高于Hec 1蛋白阳性表达的患者。表2 Hec 1蛋白表达与PGC患者生存率的关系 3 讨论 PGC 在胆道肿瘤中恶性程度很高, 早期并无特殊症状, 有明显症状就诊的患者多已属进展期, 根治性切除率低, 术后生存期短3。目前, 已发现恶性肿瘤浸润转移过程极为复杂, 包括肿瘤细胞的脱落、 在基质中的移动、 进出血管或淋巴管及在远处部位的增殖等多个步骤, 涉及多种细胞因子4, 5。而从基因和分子表达的水平也揭示了PGC 的发病与多种基因的表达异常有关。但是, 对它的研究远不及对胃癌、 大肠癌和胰腺癌的深入。因此, 对PGC 的生物学标志的研究就显得尤为重要。 Hec 1又称动粒相关蛋白2, 是一种富卷曲螺旋结构的核蛋白, 由人hec 基因编码, 642 个氨基酸组成。其N端含有至少3 个功能性结合位点: 预测的核定位序列、 Nek 2 磷酸化位点、 与Rb相互作用的特异位点; 其C 端有一系列的七个亮氨酸重复序列, 在蛋白质相互作用中起重要作用6。Hec1基因在真核生物细胞中具有高度的保守性, 在酿酒酵母中命名为Ndc80 或Tid3, 这些同源基因编码的蛋白与Hec1 在N 端的1/3有差异, 在C 端2/3 包含两个卷曲螺旋区的序列具有保守性。曾有报道通过Northern blot的方法证实在肿瘤细胞系中Hec1 的mRNA 表达比正常组织高, 且在S到M 期升高尤为明显。Hec1 在所有分裂旺盛的细胞中表达量高, 在终末分化的细胞中不表达, Hec1 在有丝分裂中与着丝粒结合, Hec1 失活导致严重的染色体分离异常, 说明Hec1 在纺锤体组装检查点中起重要的作用。本研究中, 非癌性胆囊组织、 早期PGC组织及进展期PGC组织的Hec 1蛋白表达有明显的差异, 说明Hec 1蛋白表达的上调与PGC的发生发展具有相关性。Hec 1蛋白在高、 中、 低分化型癌中, 阳性表达率呈逐渐上升趋势, 分化越低的癌组织中, Hec 1蛋白的强阳性表达率越高, 提示, Hec 1蛋白的异常高表达与肿瘤的分化程度密切相关。我们同时发现Hec 1蛋白表达与淋巴结转移和Nevin分期有关, 随着淋巴结转移的出现及Nevin 分期的进展, Hec 1蛋白的强阳性表达率明显增加。此外, 通过对患者进行术后560 mo的随访考查发现, Hec 1蛋白阳性表达的患者生存率低于其阴性表达者。 综上所述, Hec 1蛋白可能与PGC的发生、 浸润、 转移有关; 联合应用Hec 1蛋白阳性表达率与其临床病理学分级, 有助于正确判断患者的预后。【参考文献】 1 瞿 颖, 刘炳亚. 癌症高表达蛋白 Hec1在纺锤体组装检查点中的作用J. 生命科学, 2004, 16(5): 275-280.2 杜小莉, 王明荣. 癌症高表达蛋白Hec 1与染色体不稳定性J. 中国医学科学院学报, 2007, 29(1): 137-142.3 石景森, 孙学军. 原发性胆囊癌诊治的历史、 现状及展望J. 西安交通大学学报(医学版), 2007, 28(5): 473-481.4 许元鸿, 欧阳兵, 于国志, 等. PTEN、 P16表达与原发性胆囊癌病理生物学行为及预后的关系J. 世界华人消化杂志, 2007, 15(11): 1314-1317.5 范跃祖, 张景涛. 基质金属蛋白酶2及其组织抑制因子在原发性胆囊癌的表达及意义J. 中国肿瘤临床, 2004, 31(12): 675-678.6 Deluca