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细胞趋化因子受体5在病毒性肝炎患者外周血单核细胞中的表达 作者：颜学兵，张萍，吴文漪，冯霞，何静 【关键词】 细胞 摘要 :目的 研究细胞趋化因子受体5（CCR5）在乙型病毒性肝炎（HB）免疫发病机制中的作用。 方法 用流式细胞仪对20例正常人（NC）及20例HB患者外周血单核细胞（PBMC）水平进行检测，并比较其经植物凝血素（PHA）培养前后的变化。 结果 培养前NC与HB患者PBMC的CCR5的表达无明显差异（P>0.05）;培养后HB患者CCR5表达水平高于NC（P<0.05）;NC的CCR5表达均较培养前明显减少（P<0.05），而HB患者的CCR5表达虽较培养前减少，但无统计学意义（P>0.05）;急性乙型肝炎（AHB）、慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化（LC）患者的CCR5的表达有一定的差别:AHB>CHB>LC，但无统计学意义（P>0.05）。病毒复制指标阳性组CCR5的表达明显低于阴性组（P<0.05）。 结论 HB患者PBMC的CCR5的表达水平与HB的临床转归可能有一定的关系，高水平的CCR5患者预后较好;PMBC高水平CCR5的表达可能不利于乙型肝炎病毒（HBV）的复制。 关键词 :乙型肝炎;发病机制;乙型肝炎病毒;细胞趋化因子受体5 Abstract:Objective To investigate the role of CC chemokine receptor5（CCR5）in the immunological pathogenesis of hepatitis B（HB）.Methods The expression levels of CCR5in peripheral blood mononuclear cell（PBMC）were assayed by flow cytometry before and after PHA-induced cultivation in20HB patients and20normal controls（NC）.Results Before cultivation，there was no discrepancy in CCR5level between NC and HB（P>0.05）.After cultivation，CCR5was obviously lowered in NC group（P<0.05），but insignificantly in HB group（P>0.05），with the slightly lowering CCR5levels in an or-der as AHB>CHB>LC.It was also noticed that the CCR5level was lower in the HB patients positive for HBV duplicating markers than that in those who were negative（P<0.05）.Conclusion CCR5expression level in PMBC may be related to the outcome of HB，and higher levels of CCR5suggest relatively favorable prognosis and limit HBV replication. Key words:hepatitis B;pathogenesis;hepatitis B virus;CC chemokine receptor5 趋化性细胞因子是细胞因子的一个超家族，其作用的发生是通过与趋化因子的受体结合，而趋化因子受体是属于G蛋白偶联受体超家族，含有7个疏水性穿膜区段的链受体。趋化因子及其受体是一个进展非常迅猛的研究领域，近年来不断有新的趋化因子及其受体被发现。细胞趋化因子受体5（CC chemokine receptor5，CCR5）便是其中的一员14 。研究发现，外周血细胞中CCR5的表达与艾滋病病毒感染有一定的关系，同时发现CCR5还可作为细胞表面标志物，与激活的辅助性T细胞亚群1（Th1）和细胞毒性T细胞亚群1（Tc1）细胞密切相关，而CCR5与乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的关系鲜见报道。为了解乙型病毒性肝炎（hepatitis B，HB）患者体内的CCR5的表达状况，同时探讨CCR5在HB发病机制中的作用，本实验用流式细胞仪对HB患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）CCR5的表达水平进行了检测，部分作了细胞培养前后的观察。现将研究结果报道如下。 1 材料和方法 1.1 研究对象 29例HB患者为2000年1月9月徐州医学院附属医院传染科门诊及住院患者，HB诊断依据2000年西安第十次全国病毒性肝炎会议制定的诊断标准进行，并以20例健康人（NC）为对照。 1.2 方法 29例HB患者静脉血检测CCR5，比较不同临床类型CCR5的水平。20例进行淋巴细胞分离培养，比较培养前后CCR5水平。20例检测HBV复制指标，比较不同复制情况下CCR5水平。 1.2.1 标本的收集与处理 无菌采集静脉血10ml。4ml经肝素抗凝，用于淋巴细胞的分离培养;1ml用EDTA抗凝，直接用于流式细胞仪检测29例。20例血清用ELISA及PCR法检测HBV复制指标:HBeAg和HBV-DNA。 1.2.2 细胞培养与收集 常规分离PBMC，Hanks液洗3次，10%FCS-1640培养液调细胞浓度为210 9 .L，接种于24孔细胞培养板，每孔1ml。做3个复孔。用植物凝血素（PHA）诱导其增殖，终浓度为200mg.L，置37、5%CO 2 孵箱中培养48h，培养后的细胞用PBS洗涤2次，最后用200l PBS悬浮，待测CCR5。 1.2.3 流式细胞仪检测CCR5 将相应CCR5阴阳性抗体加于2只空白离心管中，分别为阳性管和阴性管，每管各加入抗凝外周血或培养后的细胞悬液100l，充分混匀，4避光反应20min。在全血样本管中加溶血剂1ml，混匀放置5min;PBS洗涤，全血样本管洗3次，培养管洗1次;沉淀用200l PBS悬浮，上流式细胞仪检测。CCR5抗体购自深圳晶美公司。 1.3 统计学处理 所有数据采用xs表示，2组间比较用t检验，检验水准:=0.05。 2 结果 2.1 PHA培养前后NC组与HB组的CCR5水平比较 培养前，NC组与HB组PBMC的CCR5的表达无明显差异（P>0.05）;培养后，HB组CCR5高于NC组（P<0.05），培养后，HB组、NC组的CCR5表达较培养前减少，HB组CCR5表达虽较培养前减少，但无统计学意义（P>0.05），而NC组减少具有统计学意义（P<0.05）。见表1。 2.2 不同临床类型肝炎患者的CCR5表达水平比较 急性乙型肝炎（acute hepatitis B，AHB）8例、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）12例、肝硬化（liv-er cirrhosis，LC）9例患者PBMC的CCR5的表达有一定的差别，AHB>CHB>LC，但无统计学意义。见表2。 表1 NC、HB组CCR5水平比较（略） 与NC组比较:*P<0.05;与培养前比较:#P<0.05 表2 HB不同临床类型PBMC的CCR5比较（略） 2.3 CCR5与病毒复制的关系 病毒复制指标阳性组的CCR5的表达明显低于阴性组（P<0.05），见表3。 表3 CCR5与HBV病毒复制的关系（略） 组间比较:*P<0.05 3 讨论 HB的发病机制研究提示:HBV感染后，能否被彻底清除与体内的专职抗原提呈细胞树突状细胞及Th1细胞的功能状态有密切的关系，而CCR5在树突状细胞及Th1细胞表面均有一定量的表达，且表达的水平与树突状细胞及Th1的激活状态密切相关，只有树突状细胞及Th1细胞表面有足够量的CCR5表达，才能趋化树突状细胞及Th1向HBV感染的部位游走，最终清除HBV;反之，如果CCR5低水平表达则不利于清除HBV，导致HBV感染得以持续。细胞因子趋化受体可以与细胞因子或机体内的吞噬细胞结合，对于清除病原体起重要的作用。 本实验中培养后HB组PBMC CCR5高于NC组，提示CCR5在病毒性肝炎患者与细胞因子或细胞结合而消耗。另一方面，PHA可以作为细胞免疫的增强剂，有利于机体内Th2及Tc2向Th1及Tc1的转化，而CCR5为Th1及Tc1的特异性表面标志5-6 ，机体内Th及Tc细胞亚群的动态平衡对于清除HBV起重要的作用7-8 ，培养后HB组与NC组存在一定的差异，说明HB患者与NC之间体内的Th及Tc亚群平衡存在一定的差异。这两方面可能是导致HBV形成持续感染的重要原因。 不同临床类型肝炎患者PBMC的CCR5的表达也存在一定的差别，即AHB>CHB>LC，且HBV复制指标阳性组的CCR5的表达明显低于阴性组，均提示PBMC的CCR5的表达水平与HBV感染后的临床转归有一定的关系。但是HBV感染是体内CCR5的高水平表达结果还是起因，还值得进一步研究。 参考文献 : 1 刘安全.趋化性细胞因子和T细胞游走的研究进展J.国外医学・免疫学分册，2000，23（3）:154-157. 2 邱为龙，熊思东.CCR5的结构和功能:近两年的研究进展J.国外医学・分子生物学分册，1999，21（1）:31-35. 3 Baggiolini M，Dewald R，Moster B.Human chemokines:an updateJ.Annu Rev Immunol，1997，15:675-705. 4 Locati M，Murphy PM.Chemokines and chemokine receptors:biology and clinical relevance in inflammation and AIDSJ.Annu Rev Med，1999，50:425-440. 5 Mosmann TR，Sad S.The expanding universe of T-cell subsets:Th1，Th2and moreJ.Immunol Today，1996，17（3）:138-146. 6 Bonecchi R，Bianchi G，Bordignon PP，et al.Differential expression of chemokine receptors and chemotactic responsiveness of type1T helper cells（Th1s）and Th2sJ.J Exp Med，1998，187（1）:129-134. 7 Halverson DC，Schwartz GN，Carter C，e